DDX6通过相分离调控代谢可塑性与化疗耐药性为急性髓系白血病提供新靶点

《Nature Communications》：DDX6 undergoes phase separation to modulate metabolic plasticity and chemoresistance

本研究针对急性髓系白血病(AML)化疗耐药性高、复发率高的临床难题，发现RNA结合蛋白DDX6通过液-液相分离(LLPS)形成处理小体(PBs)，特异性富集GC含量低的mRNA（如BCAT1）并维持其稳定性，从而重编程氨基酸代谢（特别是支链氨基酸代谢）并诱导化疗耐药。该研究不仅揭示了DDX6-PBs-BCAT1轴在AML中的关键作用，而且证实靶向DDX6可显著增强AML细胞对阿糖胞苷(Ara-C)的敏感性，为克服AML化疗耐药提供了新的治疗策略。

　　

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种致命的血液系统恶性肿瘤，其特征是髓系分化受阻和未成熟前体细胞的克隆性扩增。尽管治疗手段不断进步，标准的“7+3方案”（阿糖胞苷[Ara-C]联合蒽环类药物）仍是AML一线治疗的主要选择。然而，超过一半的AML患者会对当前化疗产生耐药或初始缓解后复发，导致患者长期生存率在过去几十年里没有显著提高。高复发率是AML患者预后不佳的主要原因，也是临床面临的重大挑战。因此，识别新的、特别是导致化疗耐药的关键分子靶点至关重要。

近年来，越来越多的证据表明，耐药细胞能够快速适应应激微环境，从而在化疗药物作用下存活。例如，应激颗粒（Stress Granules, SGs）帮助细胞抵抗包括化疗在内的各种应激源，并通过诱导细胞静息来促进化疗耐药。此外，DEAD-box解旋酶家族成员DDX3X通过促进SGs的组装来赋予药物抵抗和放射抵抗。然而，细胞质核糖核蛋白颗粒（RNP granules）是否以及如何参与白血病的发生或化疗耐药，仍然不清楚。

AML细胞，包括引发疾病的白血病干细胞（Leukemia Stem Cells, LSCs），在应对应激微环境时表现出显著的可塑性，并能通过代谢重编程来维持其不受控制的增殖。与主要依赖糖酵分的正常造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）不同，AML细胞，尤其是LSCs，严重依赖线粒体氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OxPhos）进行能量转换。氨基酸代谢的重编程深刻影响AML的疾病进展和化疗反应。特别是支链氨基酸（Branched-Chain Amino Acid, BCAA）代谢，在AML发病机制、LSC自我更新和耐药中起着重要作用。支链氨基酸转氨酶1（BCAA Transaminase 1, BCAT1）是催化BCAA分解代谢的关键酶。尽管已有这些认识，但白血病发生、RNP颗粒和代谢重编程三者之间的内在联系仍是一个谜团。

为了回答这些关键科学问题，并探索潜在的新的治疗靶点，由Rui Su和Chun-Wei Chen共同领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们设计了一个专注于细胞质液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）颗粒的CRISPR筛选文库，系统性地揭示了DEAD-box解旋酶6（DDX6）通过相分离调控代谢可塑性和化疗耐药性的新机制。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：首先，他们设计并构建了一个靶向101个高置信度SGs和PBs相关RNA结合蛋白（RBPs）的专用CRISPR文库，并在AML细胞系和患者来源异种移植（Patient-Derived Xenograft, PDX）模型中进行了体外和体内CRISPR筛选；其次，他们利用条件性基因敲除（cKO）小鼠模型评估了Ddx6缺失对正常造血的影响；第三，他们通过体外重组蛋白纯化、荧光漂白恢复（FRAP）技术、免疫荧光（IF）成像、单分子荧光原位杂交（smFISH）、RNA免疫共沉淀（CLIP）与测序、RNA稳定性测定、代谢组学（特别是稳定同位素¹³C, ¹⁵N-亮氨酸示踪）以及细胞能量代谢分析（Seahorse）等多种技术手段，深入探究了DDX6的相分离能力及其对下游靶基因（如BCAT1）和细胞代谢的调控作用。

结果

体外和体内CRISPR筛选揭示DDX6是AML中最有前景的脆弱性靶点

为了探究细胞质LLPS颗粒是否参与白血病发生，研究人员设计了一个包含2084条sgRNA的专用CRISPR文库，靶向101个在SGs和PBs中富集的高置信度RBPs。该文库被导入表达Cas9的人Mono-mac-6 AML细胞系和PDX来源的AML原始细胞中，分别进行体外和体内（移植到NSGS小鼠中）筛选。整合分析筛选结果和DepMap CRISPR评分，确定了5个对AML细胞存活至关重要的顶级RBP，包括EIF5A、DDX6、CNOT3、EIF4E和PABPC1。其中，DDX6的敲除（Knockout, KO）对PBs组装的抑制最为显著。进一步分析表明，DDX6在AML样本中表达显著上调，且其KO能显著抑制AML细胞生长，这一效应可被表达sgRNA抵抗的DDX6所逆转。机制上，组蛋白去甲基化酶KDM5B被证实通过调控DDX6表达来影响PBs的形成。

DDX6在体外和细胞内发生相分离

DDX6蛋白含有预测的N端和C端内在无序区域（Intrinsically Disordered Regions, IDRs）。研究人员发现，DDX6与PBs标志物Dcp1b共定位，并且其颗粒在荧光漂白恢复（FRAP）实验中表现出快速的流动性，表明其具有液体样特性。体外实验证实，从哺乳动物细胞或大肠杆菌中纯化的重组DDX6蛋白均能发生LLPS，形成动态的液滴，且其相分离能力受蛋白浓度和盐浓度调节。值得注意的是，poly(U)-RNA能显著增强DDX6的液滴形成，而poly(C)-RNA则不能。通过构建DDX6的截短体（DDX6-CT, DDX6-NT, DDX6-ΔIDR），研究人员发现DDX6的N端区域，特别是N端IDR结构域，对其LLPS能力和PBs组装至关重要。

DDX6促进AML细胞生长和LSC自我更新，同时抑制髓系分化

在功能上，Ddx6 KO显著抑制了MLL-AF9诱导的白血病干细胞（LSCs）的集落形成和再植能力。在多种具有不同遗传背景的AML细胞系和PDX细胞中，DDX6 KO均能抑制细胞增殖、诱导髓系分化和凋亡、并引起G₀期细胞周期阻滞。重要的是，这些表型可被DDX6野生型（WT）完全挽救，而相分离能力受损的DDX6-ΔIDR突变体则无法有效逆转KO带来的生长抑制和分化促进效应。进一步，过表达另一个关键的PBs组分LSM14A可以部分恢复DDX6 KO引起的PBs解离、生长抑制和凋亡。这些结果证明，DDX6通过其LLPS介导的PBs组装来促进AML存活。

Ddx6的缺失对正常造血影响甚微

为了评估靶向DDX6的治疗潜力，研究人员构建了Ddx6条件性敲除（cKO）小鼠模型。研究发现，无论是杂合还是纯合敲除Ddx6，对小鼠外周血白细胞、淋巴细胞、血小板、骨髓和脾脏中的原始祖细胞（如Lin^-c-Kit⁺ [LK] 和 Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺ [LSK]）群体以及成熟血细胞群体的影响均非常有限。Ddx6 KO仅导致红细胞、血红蛋白和中性粒细胞有中度减少，但对HSCs的集落形成能力没有显著影响。这表明靶向DDX6可能对正常造血系统相对安全，提供了一个潜在的治疗窗口。

DDX6维持其富集于PBs中的靶转录本稳态水平

为了阐明DDX6促进AML存活的分子机制，研究人员对DDX6 KO的AML细胞进行了转录组测序（RNA-seq），并整合了DDX6 CLIP-seq数据和已知的PBs富集/缺失转录本数据。他们将mRNA分为四组进行分析，发现DDX6倾向于负调控那些被排除在PBs之外且GC含量高的结合转录本，而正调控那些富集于PBs中且GC含量低的结合转录本。特别值得注意的是，DDX6结合且PBs富集的转录本具有显著更低的GC含量。在DDX6 KO后，这部分低GC含量的PBs富集转录本（如BCAT1）的稳态水平显著下降。基因集富集分析（GSEA）显示，这些潜在的DDX6靶标富集于细胞周期、应激反应等通路。

DDX6通过靶向BCAT1 mRNA调控AML代谢可塑性

研究人员证实BCAT1 mRNA（GC含量为37%）是DDX6的直接作用靶点。CLIP-qPCR、smFISH和体外RNA pull-down实验均证明了DDX6与BCAT1 mRNA的直接相互作用，且smFISH显示BCAT1 mRNA与DDX6蛋白在PBs内共定位。RNA稳定性实验表明，DDX6能显著延长BCAT1 mRNA的半衰期。DDX6 KO导致BCAT1表达水平在mRNA和蛋白水平均显著下降，且这一效应可被DDX6-WT而非DDX6-ΔIDR挽救。功能上，过表达BCAT1能够部分逆转DDX6 KO引起的细胞生长抑制、凋亡和细胞周期阻滞。BCAT1催化BCAA分解产生支链α-酮酸（BCKAs），后者进一步分解为乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，为三羧酸循环（TCA循环）和OxPhos供能。研究人员通过Seahorse能量代谢分析发现，DDX6 KO导致细胞耗氧率（OCR）降低，而BCAT1过表达可逆转这一效应。稳定同位素示踪实验进一步证实，DDX6 KO显著降低了¹³C或¹⁵N标记的TCA循环代谢物、非必需氨基酸（NEAAs）和核苷酸的水平，凸显了DDX6在氨基酸代谢中的核心作用。

DDX6 KO使AML细胞对化疗敏感

鉴于BCAA代谢在耐药中的作用，研究人员探讨了DDX6对AML细胞化疗反应的影响。结果显示，DDX6 KO或BCAT1敲低（KD）均能显著增强白血病细胞对Ara-C的敏感性；而BCAT1过表达则可部分逆转DDX6 KO所诱导的增敏效应。在AML“人源化小鼠”异种移植和PDX模型中，DDX6 KO联合Ara-C治疗能更有效地抑制白血病负荷、延长小鼠总体生存期，并减少AML细胞向肝脏和脾脏的浸润。

结论与意义

本研究通过创新的CRISPR筛选策略，首次系统性地揭示了DDX6及其LLPS能力在AML白血病发生中的关键作用。研究发现，DDX6通过相分离驱动PBs组装，从而作为“储存库”特异性保护其结合的低GC含量mRNA（如BCAT1）免于降解，维持其稳态水平。通过正向调控BCAT1，DDX6重编程了AML细胞的氨基酸代谢，特别是BCAA代谢，增强其线粒体OxPhos，最终导致对标准化疗药物Ara-C的耐药。尤为重要的是，Ddx6的缺失对正常造血功能影响轻微，提示靶向DDX6或其相分离能力可能成为治疗AML、克服化疗耐药的一种有前景的新策略。

这项研究不仅深化了我们对PBs生物学功能及其在疾病中作用的理解，而且为开发靶向LLPS颗粒的新型疗法提供了概念验证和潜在靶点。未来针对DDX6相分离能力的小分子抑制剂或基因沉默策略，有望为白血病治疗及克服耐药性开辟新的途径。