逆转录子-Eco7抗噬菌体防御系统的结构机制：从tRNATyr切割到流产感染

《Nature Communications》：Structural mechanism of the Retron-Eco7 anti-phage defense system

本研究通过冷冻电镜技术解析了Retron-Eco7（含逆转录酶RT、多拷贝单链DNA msDNA、ABC ATP酶PtuA和HNH核酸酶PtuB）的三维结构，揭示了其通过RT-msDNA抑制PtuA-PtuB核酸酶活性、噬菌体D15核酸酶切割msDNA激活系统、以及效应蛋白切割宿主tRNATyr引发流产感染的分子机制，为理解原核生物抗噬菌体防御策略提供了新范式。

　　

在微生物与病毒永无休止的军备竞赛中，细菌演化出了丰富多彩的防御武器库来对抗噬菌体的入侵。其中，逆转录子（Retron）作为一种独特的遗传元件，近年来被发现在抗噬菌体防御中扮演着关键角色。逆转录子通常由非编码RNA（ncRNA）、逆转录酶（RT）和多样的效应蛋白组成，能够通过产生一种特殊的RNA-DNA杂交体——多拷贝单链DNA（msDNA）来执行防御功能。然而，不同类型的逆转录子系统如何被激活、如何识别噬菌体感染、以及通过何种分子机制实现防御，仍是领域内亟待解决的核心科学问题。

在大肠杆菌中发现的Retron-Eco7系统（曾被称为Retron-Ec78）就是一个典型的例子。该系统包含RT、144个核苷酸的ncRNA以及两个效应蛋白：PtuA（ABC家族ATP酶）和PtuB（HNH家族核酸酶）。近期研究表明，Retron-Eco7能在噬菌体感染时切割宿主的tRNA^Tyr，从而提供抗噬菌体防御，且这一过程可被噬菌体编码的tRNA所抑制。但是，Retron-Eco7系统的详细作用机制，特别是其结构基础、激活途径和效应机制，仍然扑朔迷离。

为了揭开这一谜团，东京大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了Retron-Eco7复合物的高分辨率结构，揭示了该系统在原子水平上的工作机制。研究发现，Retron-Eco7通过一种精巧的“毒素-抗毒素”模式运作：在未感染状态下，RT-msDNA复合物作为“抗毒素”，与PtuA-PtuB“毒素”结合，抑制其核酸酶活性，防止细菌生长停滞；而当噬菌体入侵时，其编码的D15核酸酶作为“触发器”，切割msDNA，导致PtuA-PtuB从复合物中解离，进而切割宿主tRNA^Tyr，引发流产感染（abortive infection），最终阻止噬菌体增殖。

研究人员主要运用了冷冻电镜结构解析、点斑试验（spot assays）、生长曲线分析、ATP酶活性测定、Northern印迹、tRNA片段测序、体外核酸切割实验等一系列关键技术方法。研究使用了工程化的大肠杆菌菌株和噬菌体模型，通过分子克隆构建了各种突变体，以验证关键功能位点。

Retron-Eco7保护大肠杆菌抵抗T5样噬菌体

通过点斑试验和生长曲线分析，研究人员证实Retron-Eco7能有效防御T5和SP15m噬菌体，但对含有抗防御蛋白Rad和tRNA^Tyr（SP-tRNA^Tyr）的SP15噬菌体无效。突变分析显示，PtuA的ATP酶活性位点（D395A）和PtuB的HNH核酸酶活性位点（H57A）的突变均会废除防御活性，表明这两种酶的催化活性对Retron-Eco7介导的抗噬菌体防御至关重要。单独表达PtuA-PtuB会抑制细菌生长，而共表达RT-ncRNA-PtuA-PtuB（即完整的Retron-Eco7系统）则不会，这支持了PtuA-PtuB作为毒素、RT-msDNA作为抗毒素的模型。

Retron-Eco7复合物的结构

研究人员通过冷冻电镜解析了RT-msDNA-PtuA-PtuB复合物（即Retron-Eco7复合物）的五种状态结构，分辨率达2.6-2.8 ?。结构显示，该复合物包含一个RT分子、一个msDNA分子、四个PtuA分子（PtuA.1-PtuA.4）和两个PtuB分子（PtuB.1和PtuB.2）。msDNA的msrRNA和msdDNA区域均被RT识别，而msdDNA区域被两个PtuA二聚体夹在中间。PtuA.1还与RT和msrRNA相互作用。两个PtuB分子通过其C端结构域（CTD）与PtuA二聚体结合。结构揭示了RT-msDNA支架主要通过msDNA与PtuA二聚体的相互作用来结合两个PtuA-PtuB效应器复合物。

RT-msDNA复合物的结构

msDNA由41个核苷酸的msrRNA和73个核苷酸的msdDNA组成，形成一个非分支的RNA-DNA杂交体。RT-Eco7采用经典的右手折叠结构，由掌域、指域和拇指域构成。msDNA的茎环2（SL2）和连接区（L1/L2）被拇指域和掌域/指域广泛识别。RNA-DNA异源双链结合在由掌域、指域和拇指域形成的活性位点附近，保守的YADD基序位于msdDNA的3‘端附近。结构显示了一个逆转录反应终止状态的特征：模板核苷酸U（-49）从异源双链中翻出。功能实验证实，RT活性位点（D187A/D188A）突变或拇指域缺失（Δ235-313）会完全废除防御活性，而参与稳定终止状态的残基（如Y32A、R42A、Q46A）突变则会中度或显著降低活性。

PtuA-PtuB复合物的结构

PtuA包含N端结构域（NTD）、ATP酶结构域、卷曲螺旋（CC）结构域、连接结构域和C端结构域（CTD）。ATP酶结构域采用ABC ATP酶折叠，含有Walker A和Walker B基序。PtuA.1和PtuA.2（以及PtuA.3和PtuA.4）的ATP酶结构域形成头对头的二聚体，界面处结合有ADP分子，该二聚化由ADP介导的相互作用稳定。Walker A（N95A）、Walker B（E396A）及其相关残基（H400A）的突变会废除抗噬菌体防御活性，表明ADP介导的PtuA二聚化对功能至关重要。体外ATP酶活性实验表明，Retron-Eco7复合物中的PtuA具有ATP水解活性，而PtuA D395A突变会废除此活性。尺寸排阻色谱显示，PtuA D395A突变导致PtuA-PtuB从RT-msDNA上解离，证实PtuA介导的ADP产生对于维持复合物完整性至关重要。

PtuB由HNH核酸酶结构域和C端结构域（CTD）组成。其HNH结构域与化脓性链球菌Cas9（SpCas9）的活性构象相似，包含一个由C43、C46、C78、C90协调的锌指结构。这些半胱氨酸的丙氨酸突变（C43A/C46A/C78A/C90A）会废除防御活性。PtuB通过其CTD与PtuA的CTD相互作用。

RT-msDNA-PtuA-PtuB相互作用对抗噬菌体防御至关重要

两个PtuA-PtuB复合物主要通过msdDNA与PtuA二聚体的相互作用与RT-msDNA支架结合。PtuA.1、PtuA.3和PtuA.4的残基（如R126、R163、R171、K180）与msdDNA的碱基或磷酸骨架相互作用。这些残基的突变会削弱防御活性。PtuA.1的NTD与msrRNA的糖磷酸骨架相互作用。缺失PtuA N端的两个α螺旋（残基3-36）会废除防御活性。PtuA和PtuB之间以及各结构域（如PtuA的CC域、CTD和PtuB的CTD）的相互作用对复合物形成和功能也至关重要。表达带有PtuA R126A或R163A突变的Retron-Eco7的大肠杆菌细胞出现生长缺陷，凸显了PtuA-msdDNA相互作用在抑制PtuA-PtuB毒性中的重要性。

Retron-Eco7在噬菌体感染时切割大肠杆菌tRNA^Tyr

Northern印迹分析证实，在感染SP15m噬菌体后，携带Retron-Eco7的大肠杆菌细胞中出现了Ec-tRNA^Tyr的切割片段，而未感染细胞或缺乏Retron-Eco7的细胞中则没有。PtuA（D395A）或PtuB（H57A）突变均导致切割片段消失。tRNA片段测序将切割位点定位于Ec-tRNA^Tyr可变环区的U47和C48之间。

噬菌体编码的tRNA^Tyr中和PtuA-PtuB毒性

Northern印迹显示，在表达Retron-Eco7的细胞中，Ec-tRNA^Tyr被切割，而噬菌体编码的SP-tRNA^Tyr和大肠杆菌tRNA^Gly未被切割。SP-tRNA^Tyr具有更长的可变环，这可能是其避免被切割的原因。共表达Retron-Eco7与SP-tRNA^Tyr会抑制对SP15m的防御，而共表达Ec-tRNA^Tyr或SP-tRNA^Tyr突变体（可变环缺失或被Ec-tRNA^Tyr的更短环替换）则不会。此外，共表达PtuA-PtuB与Ec-tRNA^Tyr或SP-tRNA^Tyr能中和PtuA-PtuB的毒性，使细胞正常生长。这表明SP-tRNA^Tyr通过补偿被切割的Ec-tRNA^Tyr来抑制Retron-Eco7的防御。

Tyr的切割。a Ec-tRNA^Tyr、SP-tRNA^Tyr和Ec-tRNA^Gly的Northern印迹分析。b Ec-tRNA^Tyr和SP-tRNA^Tyr示意图。Retron-Eco7切割Ec-tRNA^Tyr的位点用黄色三角形表示。c 噬菌体编码的SP-tRNA^Tyr对Retron-Eco7的抑制。d 共表达PtuA-PtuB与Ec-tRNA^Tyr、SP-tRNA^Tyr或Ec-tRNA^Gly的大肠杆菌细胞生长曲线。'>

Retron-Eco7由噬菌体编码的D15核酸酶触发

从逃逸SP15m噬菌体感染的突变体中，研究人员发现其D15核酸酶基因发生点突变（R86Q和R86L）。D15具有内切核酸酶活性。体外实验表明，纯化的野生型D15能切割Retron-Eco7复合物中的msdDNA，但其突变体（R86L/R86Q）则不能。D15处理后的Retron-Eco7复合物在尺寸排阻色谱上出现两个峰，分别对应解离的PtuA-PtuB和RT-msDNA，表明D15介导的msDNA切割促进了PtuA-PtuB的解离。然而，无论是否经D15处理，纯化的Retron-Eco7复合物在体外均不能有效切割Ec-tRNA^Tyr或SP-tRNA^Tyr，且共表达Retron-Eco7和D15并未诱导细菌生长停滞，提示可能还需要其他未知因子参与系统的完全激活。

本研究通过整合结构生物学、生物化学和细胞生物学方法，系统地阐明了Retron-Eco7抗噬菌体防御系统的分子机制。研究揭示了一个精细的调控模式：在稳态下，RT-msDNA作为抗毒素，通过物理结合和空间位阻抑制PtuA-PtuB毒素的活性；噬菌体感染时，其D15核酸酶作为特异性触发器，切割msDNA“传感器”，导致毒素-抗毒素复合物解离，释放出的PtuA-PtuB进而切割宿主tRNA^Tyr，通过引发流产感染来限制噬菌体传播，保护细菌群体。

该研究的意义重大。首先，它提供了第二个被精细解析的逆转录子复合物结构（继Retron-Eco1之后），揭示了逆转录子系统共同的核心原则——利用RT-msDNA作为支架招募和抑制效应蛋白，以及其结构和机制上的多样性。其次，它鉴定D15为I-A型逆转录子的通用触发蛋白，扩展了我们对逆转录子如何感知噬菌体感染的认识。第三，该研究揭示了tRNA切割作为一种抗噬菌体防御策略，与近期报道的PARIS系统有异曲同工之妙，凸显了靶向核心细胞成分以破坏蛋白质合成、从而阻止噬菌体增殖的保守策略。最后，研究阐明了噬菌体如何通过编码分子模拟物（如SP-tRNA^Tyr）来巧妙对抗宿主防御，深化了对宿主-噬菌体共进化“军备竞赛”的理解。

尽管这项研究取得了突破性进展，但一些问题仍有待探索，例如PtuA-PtuB如何被完全激活以切割tRNA^Tyr（体外实验未能重现此活性），以及是否存在其他宿主或噬菌体因子参与调控。此外，Retron-Eco7与同属I-A型的、但靶向ssDNA的Retron-Eco4系统在底物特异性决定因素和激活机制上的差异，也是未来研究的方向。总之，这项工作不仅揭示了Retron-Eco7系统的独特工作机制，也丰富了我们对原核生物抗病毒防御策略多样性和复杂性的认知，为开发新型抗菌或生物技术工具提供了新的思路和结构基础。