裂殖酵母中PCNA与Rad52的多聚SUMO化修饰限制着丝粒重组的新机制

《Nature Communications》：PolySUMOylation of PCNA and Rad52 restricts centromeric recombination in fission yeast

本研究针对真核生物中SUMO链在基因组稳定性维持中的未知功能，通过系统性探究裂殖酵母着丝粒区域的自发复制应激与DNA损伤修复机制，揭示了PCNA与Rad52的多聚SUMO化修饰通过调控复制后修复通路选择，抑制着丝粒异常重组的分子途径。研究人员开发并优化了Split-SUMO-ID蛋白质组学技术，发现SUMO链缺失导致PCNA过度泛素化，进而驱动Rad52介导的着丝粒重组升高；而人工将SUMO链锚定至Rad52可逆转该缺陷。该研究首次阐明了SUMO链在着丝粒稳定性维持中的关键作用，为癌症基因组不稳定性研究提供了新视角。

　　

在真核细胞中，基因组每时每刻都面临着内源性和外源性因素的威胁。即使在正常生长条件下，DNA复制过程也极易因复制叉停滞而产生突变，这种现象被称为复制应激（Replication Stress, RS）。复制叉停滞可能导致单链DNA（ssDNA）缺口甚至双链断裂（DSB）的形成，进而引发基因组不稳定——这正是肿瘤发生的早期关键驱动因素之一。为了应对这一挑战，细胞进化出了复杂的复制应激响应（RSR）机制，其中同源重组（HR）是确保DNA复制准确完成的重要途径。然而，如何在难以复制的基因组区域（如着丝粒）精确调控修复通路的选择，仍是领域内未解的核心问题。

SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）作为一种保守的蛋白质翻译后修饰，通过调控靶蛋白的活性、定位和稳定性，在DNA复制、损伤修复和细胞周期进程中发挥关键作用。与泛素类似，SUMO可形成多聚链（polySUMOylation），但其在DNA代谢中的具体功能，尤其是在着丝粒这一重复序列密集区域的作用机制，尚不清晰。着丝粒作为染色体分离的核心功能单元，其稳定性对细胞存活至关重要。在裂殖酵母中，着丝粒结构与人类高度相似，成为研究着丝粒生物学的理想模型。前期研究表明SUMO化与着丝粒功能密切相关，但SUMO链是否以及如何影响着丝粒区域的DNA修复选择，仍待阐明。

为了解决这一问题，发表在《Nature Communications》上的最新研究，以裂殖酵母为模型，深入探究了SUMO链在DNA代谢中的作用。研究人员发现，SUMO链的缺失会导致自发复制应激和DNA损伤水平升高，并显著提升着丝粒区域的重组频率。为了解析SUMO依赖的相互作用组，团队创新性地优化了Split-SUMO-ID蛋白质组学技术，实现在Rad52修复位点附近鉴定SUMO化修饰的蛋白质。这一技术揭示了复制关键因子PCNA是重要的SUMO链修饰靶点。进一步机制研究表明，PCNA的多聚SUMO化通过拮抗Rad8介导的PCNA多聚泛素化，调控了停滞复制叉处修复通路的选择。在缺乏SUMO链的情况下，过度的PCNA泛素化会错误地激活模板转换（Template Switching, TS），导致Rad52介导的着丝粒重组异常升高。而令人惊讶的是，人工将SUMO链锚定至Rad52蛋白本身，即可有效抑制这一缺陷。该研究不仅揭示了SUMO链通过调控PCNA和Rad52的修饰状态来限制着丝粒重组的新机制，还为理解着丝粒稳定性维持提供了重要理论依据。

在研究过程中，作者运用了几个关键的技术方法：首先，利用SUMO链缺失突变体（SUMO-KallR）结合细胞生物学手段（如免疫荧光、Edu掺入实验）评估内源复制应激水平；其次，通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和校准技术，精确分析了着丝粒核心组蛋白Cnp1（CENP-A）的定位变化；再者，创新性地建立了适用于裂殖酵母的Split-SUMO-ID邻近标记技术，用于鉴定Rad52修复中心的SUMO化相关蛋白；最后，通过蛋白互作分析（Ni-NTA pull-down）和遗传学手段，验证了PCNA和Rad52的SUMO化修饰及其功能关联。

SUMO链减轻内源性复制应激

研究人员发现，SUMO链缺失突变体（SUMO-KallR）在无外界压力下即表现出RPA（复制蛋白A）和Rad52焦点数量显著增加，表明自发DNA损伤水平升高。通过EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入实验进一步证实，SUMO-KallR细胞中非S期细胞进行DNA合成的比例明显高于野生型，说明SUMO链缺失导致复制叉进展延迟。这些结果说明SUMO链在缓解内源性复制应激中发挥重要作用。

SUMO链通过调控着丝粒组织蛋白定位维护着丝粒结构

SUMO链缺失导致着丝粒标记蛋白Mis6与RPA的共定位频率增加，且细胞对微管抑制剂噻苯达唑（TBZ）的敏感性增强，提示着丝粒功能受损。通过荧光显微镜和ChIP-seq分析发现，SUMO-KallR突变体中着丝粒核心组蛋白Cnp1（CENP-A）从中央结构域异常扩散至外侧重复序列区域，但蛋白总量未变，表明SUMO链缺失破坏了Cnp1的正确定位，而这一过程不依赖于STUbL（SUMO靶向泛素连接酶）通路。

着丝粒区域的重组修复依赖SUMO链的形成

ChIP-qPCR结果显示，SUMO-KallR突变体中Rad52和Rad51在着丝粒区域的结合显著增强。利用着丝粒特异性重组报告系统，研究人员发现SUMO链缺失导致着丝粒区域基因转换频率显著上升，而染色体臂上的重组率反而下降，说明SUMO链特异性抑制着丝粒区域的重组。

Split-SUMO-ID蛋白质组学鉴定SUMO依赖的Rad52相互作用组

为了在Rad52修复位点捕获SUMO修饰的蛋白质网络，研究人员将Split-TurboID系统与SUMO修饰机制耦合：NTurbo片段与SUMO或SUMO-KallR融合，CTurbo片段与Rad52融合。当SUMO化靶标与Rad52空间接近时，TurboID酶活性恢复，对邻近蛋白进行生物素标记。质谱分析结果显示，在野生型背景下，复制因子PCNA（Pcn1）、DNA聚合酶δ亚基Pol3、组蛋白H2B（Htb1）等蛋白在SUMO-ID样本中显著富集；而在SUMO-KallR背景下，这些蛋白的富集程度大幅下降，表明SUMO链是Rad52修复中心蛋白互作的重要调控因素。

PCNA是SUMO化修饰的关键靶点并调控着丝粒重组

Ni-NTA pull-down实验证实裂殖酵母PCNA可发生单SUMO化和多聚SUMO化修饰，且修饰水平依赖于E3连接酶Pli1而非Nse2。SUMO链缺失导致PCNA的泛素化水平显著升高，尤其是Rad8介导的多聚泛素化。遗传学实验表明，引入pcn1-K164R（无法被泛素化）或删除rad8+可抑制SUMO-KallR突变体的TBZ敏感性和着丝粒重组率升高表型，说明SUMO链通过抑制PCNA的过度泛素化，限制错误修复通路激活。

Rad52的多聚SUMO化修饰保障着丝粒稳定性

生物信息学预测和实验验证均表明Rad52是SUMO化修饰靶点。研究人员构建了Rad52-SUMOchain（Rad52-Schain）菌株，即在Rad52羧基端融合四个SUMO分子。结果显示，Rad52-Schain可显著抑制SUMO-KallR背景下的着丝粒重组率升高和TBZ敏感性，并减少Rad52焦点形成。然而，该修饰未能逆转Cnp1的错误定位，说明SUMO链通过不同机制分别调控着丝粒重组和结构组织。

本研究系统阐明了SUMO链在着丝粒稳定性维持中的双重作用：一方面，PCNA的多聚SUMO化通过拮抗Rad8介导的泛素化，调控停滞复制叉处修复通路的选择，抑制错误的模板开关激活导致的着丝粒重组；另一方面，Rad52自身的多聚SUMO化可直接限制其在该区域的招募和活性。这些发现揭示了SUMO链作为一种关键分子信号，在难度复制区域精细调控DNA修复通路选择、维持基因组稳定性的新机制。该研究不仅深化了对SUMO链生物学功能的理解，也为探讨癌症中着丝粒异常和基因组不稳定性提供了新的理论框架和潜在靶点。