解析P2X7受体物种特异性药物反应差异的结构基础及转基因模型在药物研发中的应用

《Nature Communications》：Understanding interspecies drug response variations between human and rodent P2X7 receptors

本刊推荐：研究人员针对P2X7受体调节剂在临床转化中因人类遗传变异和物种依赖性药物反应而面临的挑战，开展了人源与啮齿类P2X7受体间药物反应差异机制研究。通过冷冻电镜结构解析、分子动力学模拟和功能实验，发现中央口袋门户(PCP)内PCP1亚口袋的V312-Y295-M105-F103-P96基序是物种选择性的关键决定因素。研究成功构建了P2rx7A312V/A312V基因编辑小鼠模型，为评估物种特异性P2X7抑制剂的疗效提供了有力工具，推动了更精确高效的药物发现进程。

　　

在药物研发领域，P2X7受体作为治疗疼痛、肿瘤、炎症、难治性慢性咳嗽和类风湿性关节炎等多种疾病的重要靶点，吸引了众多制药公司的关注。然而，尽管已有不少候选药物进入临床试验主要阶段，但鲜有药物最终获批上市。Gefapixant(AF-219)虽在日本和欧盟获批，却未能在美国等主要医药市场获得上市许可，凸显了P2X受体靶向药物临床试验进展缓慢且成功率低的困境。

尤为突出的是P2X7受体拮抗剂的研发困境，它们未能成功推进到II期临床试验之后。这一挑战的部分原因在于P2rx7基因中存在较多非同义多态性(nsSNP)位点，这些位点会影响P2X7与配体的结合，从而影响药效。更棘手的是，人类与模型动物之间P2rx7基因的差异导致了不同物种间配体调节P2X7受体的巨大变异。这种物种差异，特别是在药物结合位点上的差异，给P2X7化合物的合理设计带来了巨大挑战。

面对这一难题，研究人员将目光投向了P2X受体的变构调节位点——中央口袋门户(PCP)。这是一个位于P2X受体中央口袋入口处的变构结合位点，由刚性β-折叠构成，包括β2、β3、β4、β7和β8。PCP可进一步分为三个亚口袋：PCP1、PCP2和PCP3，它们为小分子提供了不同的结合模式。

为了阐明PCP位点配体识别的分子机制并探索物种特异性，研究团队开发了基于小檗碱(berberine)的化合物PSFL384-2，并分离出其对应异构体PSFL1191和PSFL1190。令人惊讶的是，尽管PSFL1190和PSFL1191仅在手性上存在差异，但它们对hP2X7的表观亲和力却相差超过50倍，突出了PCP形状互补性在决定配体亲和力中的关键作用。

通过冷冻电镜技术，研究团队解析了PSFL1191和JNJ-54175446与熊猫P2X7(pdP2X7)复合物的高分辨率结构。结果显示，PSFL1191结合诱导了PCP及其周围氨基酸更显著的构象变化(均方根偏差，RMSD=0.807?)，而JNJ-54175446引起的变化较小(RMSD=0.573?)。这种差异解释了PSFL1191的表观亲和力比JNJ-54175446低约10-20倍的原因。

关键发现在于两种配体结合深度的差异：PSFL1191的结合位点位于PCP的更深处(PCP1亚位点)，其关键原子C12和C14朝向pdP2X7 V312、M105和Y295，而含氧杂环朝向PCP内部，靠近F103和P96。相反，JNJ-54175446的结合位点更靠近PCP的中部(PCP2亚位点)，其底部含氮杂环主要被由F103、F95和Y298残基形成的亚口袋容纳，与M105、V312和Y295保持一定距离。

物种选择性机制的核心在于PCP1中的一个深部基序(V312-Y295-M105-F103-P96)。在hP2X7、pdP2X7、mP2X7和rP2X7的PCP核心区域，两个残基存在显著差异：F108和V312(按hP2X7编号)。研究人员发现，h7V312是导致PCP1靶向配体物种特异性差异的关键氨基酸，它与F103、Y295、M105和P96形成亚口袋，并与PSFL1191发生疏水相互作用。

主要关键技术方法包括：冷冻电镜结构解析获得了PSFL1191和JNJ-54175446与熊猫P2X7受体复合物的高分辨率结构(分辨率分别为4.0?和3.3?)；常规分子动力学模拟用于验证复合物稳定性；高通量虚拟筛选基于PCP1和PCP2构象筛选P2X7抑制剂；基因编辑技术构建了P2rx7^A312V/A312V点突变小鼠模型；电生理学技术评估化合物对P2X7受体功能的抑制效果；巨噬细胞吞噬实验检测化合物对细菌吞噬能力的影响。

PSFL1191作为研究P2X7受体PCP位点物种特异性的化学工具

研究显示，PSFL1191对hP2X7和pdP2X7具有相似的抑制效果，IC₅₀值分别为0.248±0.017μM和0.754±0.018μM，但对mP2X7和rP2X7的抑制效果显著降低。在30μM浓度下，PSFL1191仅能抑制mP2X7和rP2X7的13.3±3.04%和4.94±1.43%。这种显著的物种差异性使PSFL1191成为研究PCP结合选择性和人源与动物P2X7受体药效差异的宝贵工具。

PSFL1191和JNJ-54175446与P2X7通过PCP1和PCP2相互作用的确认

通过点突变和共价占据实验，研究人员确认了PSFL1191和JNJ-54175446与P2X7受体的相互作用机制。对于PSFL1191，突变pd7F88A、pd7D92F、pd7T94I、pd7P96G、pd7F103A、pd7F103W、pd7M105A、pd7M105F、pd7F108A、pd7Y295A、pd7K297R、pd7Y298A、pd7Y298F、pd7E305F、pd7V312F和pd7V312A显著减弱了10μM PSFL1191的抑制效果。即使在其最大可溶浓度30μM下，这些突变体的抑制率也不超过50%，表明其效能较pd7WT(IC₅₀=0.754±0.018μM)显著降低。

P2X7-PCP/抑制剂相互作用中亲和力、选择性和物种特异性的决定因素

研究揭示了P2X7 PCP1和PCP2实现高亲和力、亚型选择性和物种特异性配体识别的机制。PCP的刚性和其有限适应配体的能力可能是PCP1残基序列物种特异性的基础。研究人员发现，在hP2X7、pdP2X7、mP2X7和rP2X7的PCP核心区域，两个残基存在显著差异：F108和V312。通过生成小鼠和人类PCP残基的突变体，特别是mP2X7Y108F、mP2X7A312V和mP2X7Y108F/A312V，证实了V312是导致物种特异性差异的关键氨基酸。

通过PCP1和PCP2的高通量虚拟筛选发现具有物种特异性和非特异性特性的P2X7抑制剂

利用PCP1和PCP2构象进行的高通量虚拟筛选，成功鉴定出多种P2X7抑制剂。基于JNJ-54175446/pdP2X7复合物的PCP2构象作为虚拟筛选模板，获得了PSFL1633和PSFL1632等不显示物种差异的抑制剂。相反，基于PSFL1191/pdP2X7复合物的PCP1构象筛选出的PSFL2763、PSFL2780、PSFL2783和PSFL2784等化合物则表现出显著的物种特异性差异。

构建和功能验证携带P2rx7^A312V/A312V突变的小鼠以研究物种特异性P2X7抑制剂

为解决物种特异性P2X7受体抑制剂在 rodent 模型中评估的难题，研究团队构建了P2rx7^A312V/A312V基因编辑小鼠。重要的是，A312V突变并未改变mP2X7的基本功能：m7WT和m7A312V的最大电流密度相当；对ATP的表观亲和力约为1mM；电流促进特性未受影响；NMDG渗透性保持不变。这些结果表明P2rx7^A312V/A312V基因编辑小鼠是进一步研究的可行模型。

PSFL1191对P2rx7^A312V/A312V和P2rx7^+/+小鼠伤口愈合的不同影响

在伤口感染模型中，PSFL1191显著延缓了P2rx7^A312V/A312V小鼠的伤口愈合，而从第3天开始，PSFL1191处理的P2rx7^A312V/A312V小鼠的伤口面积显著大于P2rx7^+/+小鼠。与此相反，PSFL1191并未影响P2rx7^+/+小鼠的伤口愈合速率，表明PSFL1191的效应与P2X7受体相关。

PSFL1191通过抑制P2X7受体调节巨噬细胞的吞噬作用

进一步的研究证实，PSFL1191通过抑制THP-1 M1细胞中的P2X7受体活性，降低了其对金黄色葡萄球菌的吞噬能力。当使用靶向P2rx7的siRNA下调hP2rx7表达后，PSFL1191对THP-1 M1细胞吞噬能力的影响被有效消除，证实了PSFL1191是通过抑制P2X7受体活性来降低巨噬细胞的吞噬功能。

研究结论表明，物种变异是P2X受体变构调节位点的一个显著特征，特别是在P2X7受体的PCP位点表现得尤为明显。通过冷冻电镜结构解析、分子动力学模拟和功能实验，研究人员揭示了配体与PCP结合差异导致的物种特异性机制，并确定形状互补性是影响这些差异的关键因素，而非氢键等配体相互作用。

基于这些发现构建的P2rx7^A312V/A312V小鼠模型，在保持正常生理功能的同时，对物种特异性化合物表现出体内活性，为评估P2X7抑制剂在不同物种变异中的疗效和安全性提供了宝贵方法。这一研究成果不仅建立了P2X7调节中物种药理学差异的结构基础，还强调了转基因模型作为预测治疗效力的有力工具，从而实现更精确、高效的药物发现。

这项研究的意义在于为解决P2X受体靶向药物开发中的物种差异问题提供了创新性解决方案，为未来针对P2X7受体的药物研发和临床转化奠定了坚实基础，对推动精准医疗和高效药物开发具有重要价值。