靶向KRAS隐秘口袋的纳米抗体发现及其功能验证揭示新型变构抑制机制

《Nature Communications》：Identification and characterization of binders to a cryptic and functional pocket in KRAS

本研究针对RAS蛋白（尤其是KRAS）因突变高频驱动肿瘤发生且长期被视为“不可成药”靶点的难题，通过mRNA展示和酵母展示技术筛选获得了特异性结合KRAS新型“背侧口袋”（back-pocket）的纳米抗体KM12-AM。该抗体通过变构机制干扰cRAF CRD结构域与RAS的结合，有效抑制MAPK信号通路，且与临床批准的Switch-II（SwII）口袋抑制剂（如MRTX1133）具有协同潜力，为克服现有靶向药物耐药提供了新策略。

　　

在肿瘤研究领域，RAS基因家族堪称"最难对付的敌人"。作为控制细胞增殖的关键分子开关，RAS蛋白的突变形式在三大致命癌症类型中高频出现，成为肿瘤发生和发展的核心驱动因素。尽管科学界投入了大量研发精力，但RAS蛋白的小球状结构和缺乏明显结合口袋的特点，使其长期被视为"不可成药"靶点。

近年来，针对KRAS^G12C突变体的共价抑制剂（如sotorasib和adagrasib）在临床取得突破，这些药物主要作用于KRAS的Switch-II（SwII）口袋，但仅能结合并稳定KRAS的GDP失活状态。在致癌环境中，KRAS主要存在于GTP结合的活性状态，且肿瘤细胞会通过多种机制产生耐药，包括SwII口袋的突变，这凸显了寻找新靶向策略的紧迫性。

针对这一挑战，诺华生物医学研究中心的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新研究。他们采用了一种双管齐下的策略：利用mRNA展示技术筛选大环肽库，以及通过酵母展示技术筛选纳米抗体（VHHs）库，旨在发现能够结合RAS蛋白新型口袋的高亲和力配体。

关键技术方法包括：mRNA展示筛选大环肽库（使用Flexizyme技术）和酵母展示筛选纳米抗体库（库容2×10⁹）；表面等离子共振（SPR）分析结合亲和力；X射线晶体学解析结合模式；TR-FRET竞争实验评估蛋白互作；细胞水平验证通过NanoBit内源相互作用系统、免疫共沉淀和哺乳动物双杂交实验等进行功能验证。

发现KM12：一种与RAS具有亲和力的独特VHH

研究人员通过对KRAS^G12V进行三轮酵母展示筛选，从12个候选克隆中鉴定出KM12纳米抗体。测序分析显示这些克隆的CDR3区域具有惊人的多样性。通过误差倾向PCR（error-prone PCR）库筛选，团队进一步获得了亲和力提高20倍以上的优化变体KM12-AM（含Tyr102和Tyr104突变为Phe），其对多种RAS蛋白的K_D值在7-22 nM范围内。

X射线晶体学研究揭示了KM12-AM独特的结合模式：其CDR3环诱导RAS蛋白形成一个新的"背侧口袋"，这一隐秘口袋的打开涉及Tyr157和Lys42构象重组，以及由β-链2和3组成的互连开关区域的1.5?位移。

KM12-AM在不干扰SwII口袋占据的情况下影响RAS功能

研究发现KM12-AM的结合位点与cRAF的CRD（半胱氨酸富集结构域）结构域在RAS上的结合区域重叠。SPR实验证实，虽然单独的CRD结构域对KRAS^G12D没有可检测的亲和力，但其存在显著增强了cRAF RBD（RAS结合结构域）的结合（K_D从130 nM提高至16 nM）。TR-FRET竞争实验显示，cRAF RBD-CRD和CRD能几乎完全竞争KM12-AM与RAS的结合，而单独的RBD仅能部分置换。

此外，KM12-AM还能抑制RAS固有的GDP/GTP交换速率（IC₅₀约26-28 nM），表明其通过至少两种机制干扰RAS功能。重要的是，SPR竞争实验证明，SwII口袋抑制剂MRTX1133不影响KM12-AM与RAS的结合，提示两种靶向策略具有协同潜力。

KM12-AM选择性抑制细胞中的MAPK信号

细胞实验证实KM12-AM能特异性结合内源性和外源性KRAS，而其结合缺陷型变体（KM12-AM-AA）则无此能力。在PATU8988T细胞（内源性表达SmBit-KRAS^G12V和LgBiT-cRAF）中，KM12-AM表达显著降低了重建的纳米荧光素酶信号，表明其能破坏RAS/cRAF复合物形成。

Western blot和免疫荧光分析显示，KM12-AM（而非KM12-AM-AA）在HEK293和HCT116（KRAS^G13D）细胞中显著降低pERK水平，证实其在细胞中有效抑制MAPK信号通路。

背侧口袋内的离散突变扰动改变RAS致癌特性

为验证背侧口袋靶向的治疗潜力，研究人员构建了关键残基突变体（L23E、V44W、V45D/E）。SPR和哺乳动物双杂交实验显示，这些突变对cRAF RBD结合影响较小，但显著削弱了cRAF RBD-CRD的结合（亲和力降低4-6倍），其中V45D/E突变几乎完全消除了相互作用。

在SW1990细胞模型中，表达KRAS^G12D/V45D突变体无法有效恢复pMEK和pERK水平，且不能挽救KRAS沉默导致的集落形成抑制，而野生型KRAS^G12D则具有完全拯救能力。这些结果表明，破坏RAS与cRAF CRD的相互作用足以抑制KRAS的致癌功能。

研究结论与意义

该研究通过创新性的展示技术平台，发现了首个靶向RAS"背侧口袋"的纳米抗体KM12-AM。这一隐秘口袋的发现打破了长期以来对RAS"不可成药"的认识，揭示了变构调控RAS功能的新途径。

与现有靶向策略相比，背侧口袋靶向具有独特优势：能同时影响GDP结合（失活）和GTP结合（活性）状态的RAS功能；与临床批准的SwII口袋抑制剂非竞争性，允许联合治疗；可能减少耐药突变的发生。分子对接分析显示，该口袋的配体能力评分为0.92，体积为112?³，具有良好的小分子药物开发潜力。

尽管纳米抗体本身难以用于细胞内靶点，但此项工作为开发靶向这一新型口袋的小分子药物提供了概念验证和结构基础。未来针对不同RAS突变等位基因的差异化筛选策略，可能进一步提高治疗的选择性和安全性。

此项研究不仅为克服RAS靶向治疗的耐药问题提供了新思路，也展示了利用大环肽和纳米抗体等工具探索蛋白质动态构象空间的强大能力，为其他"不可成药"靶点的开发提供了宝贵借鉴。