不完全射频消融后残留肿瘤细胞通过诱导CD177hiPAD4hi中性粒细胞促进肺癌转移

《Nature Communications》：Residual tumor cells after insufficient radiofrequency ablation promote lung metastasis by educating CD177hiPAD4hi neutrophils

本研究针对结直肠癌肝转移（CRLM）不完全射频消融（iRFA）后易发生肺转移的临床难题，揭示了残留肿瘤细胞通过PPARγ-甘油三酯（TG）合成-P38 MAPK信号轴激活CXCL5分泌，进而诱导CD177hiPAD4hi中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），通过MEK/ERK通路驱动转移的新机制。研究同时发现CD36hi上皮-间质转化（EM）循环肿瘤细胞（CTCs）可作为iRFA早期识别标志，为改善RFA疗效提供了新靶点和策略。

　　

对于确诊结直肠癌的患者来说，最令人担忧的莫过于发生肝转移。当癌细胞扩散到肝脏，治疗选择往往变得有限。射频消融（RFA）作为一种微创局部治疗技术，通过高频电流产生热量“烧死”肿瘤，已成为不适合手术的结直肠癌肝转移（CRLM）患者的重要希望。然而，临床上一个棘手的现象是，高达60-80%的患者在接受RFA治疗后5年内会出现复发，尤其是发生远处肺转移，严重影响了患者的长期生存。这背后的原因究竟是什么？是治疗时癌细胞“逃逸”了，还是“烧”得不彻底留下了隐患？这些残留的肿瘤细胞又是如何获得更强的转移能力？这些问题一直困扰着临床医生和研究人员。

近日，发表在《Nature Communications》上的一项研究为解开这一谜团提供了重要线索。由南方医科大学南方医院肿瘤科黄娜、方贻胜、郑思婷等作为共同第一作者，廖旺军、石敏、吴祖强作为共同通讯作者的研究团队发现，不完全射频消融（iRFA）后残存的肿瘤细胞并非“苟延残喘”，而是发生了深刻的代谢重编程，它们“教育”了一群特殊的中性粒细胞，共同充当了肺转移的“帮凶”。这项研究不仅揭示了iRFA促进转移的新机制，还提出了早期识别和干预的新策略。

研究人员为了回答这些问题，综合运用了多种关键技术方法。他们首先回顾性分析了167例CRLM患者的临床资料，并建立了稳定的小鼠iRFA模型（包括BALB/c小鼠的CT26模型和C57BL/6小鼠的MC38模型）来模拟临床过程。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，他们精准解析了肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的动态变化。此外，脂质组学分析、 Seahorse能量代谢分析、流式细胞术、免疫荧光、Western blotting、酶联免疫吸附试验（ELISA）、体外细胞共培养模型以及循环肿瘤细胞（CTC）检测等分子和细胞生物学技术被广泛应用于机制探索。研究还利用了癌症基因组图谱（TCGA）中结直肠癌（TCGA-COREAD）队列的公共数据进行生物信息学分析验证。

研究结果

残留肿瘤细胞是iRFA后肺转移的根源

通过对167例CRLM患者的回顾性分析，研究人员发现iRFA组患者发生新发肝外转移的时间显著短于完全消融（cRFA）组和肝切除组。为了探究转移的细胞起源，他们构建了双侧肝叶肿瘤植入小鼠模型，并分别对左叶或右叶肿瘤进行iRFA。令人信服的是，肺转移灶中的肿瘤细胞特异性地来源于被消融的肝叶肿瘤，而非对侧未受直接热刺激的肿瘤。通过建立iRFA后不同时间点切除残留肿瘤的模型，他们进一步证实，iRFA后立即（第1天）切除残留肿瘤几乎能完全抑制肺转移，而延迟切除则效果减弱，这强有力地证明了残留肿瘤细胞是导致转移的“元凶”。

中性粒细胞是iRFA促进肺转移的“帮凶”

对iRFA处理的小鼠肿瘤组织进行批量RNA测序（RNA-seq）和基因本体（GO）富集分析显示，中性粒细胞趋化、迁移等相关通路被显著激活。免疫组化和流式细胞术证实，iRFA后肿瘤组织中CD45⁺Cd11b⁺Ly6G⁺中性粒细胞数量显著增加，而淋巴细胞、巨噬细胞等未见明显变化。更重要的是，使用抗Ly6G抗体清除中性粒细胞后，iRFA诱导的肺转移被显著抑制。这些结果表明，中性粒细胞在iRFA后的转移过程中扮演了关键角色。

Cd177^hiPad4^hi中性粒细胞通过NETs驱动转移

为了深入解析中性粒细胞亚群，研究人员对分选出的CD45⁺细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析结果鉴定出四个中性粒细胞亚群，其中N3亚群（Cd177^hiPad4^hiMki67^-）在iRFA样本中比例显著升高。Pad4（肽基精氨酸脱亚胺酶4）是形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的关键酶。进一步的实验表明，这群Cd177^hiPad4^hi中性粒细胞（通过表面标志Cd177^hiS100a6^hi分选）具有最强的NETs形成能力。当使用Pad4抑制剂GSK484或DNA酶I破坏NETs时，中性粒细胞对肿瘤细胞迁移的促进作用被抵消。在动物模型中，抑制NETs形成同样能有效减轻肺转移。这表明，Cd177^hiPad4^hi中性粒细胞主要通过释放NETs来促进转移。

残留肿瘤细胞的脂代谢适应是NETs形成的驱动力

那么，iRFA后的残留肿瘤细胞是如何“教育”中性粒细胞的呢？RNA-seq提示PPAR信号通路在iRFA肿瘤中显著激活。脂质组学分析发现，经历亚致死热刺激（45°C模拟iRFA条件）的肿瘤细胞内甘油三酯（TG）和脂滴（LDs）含量显著增加。体内外实验证实，iRFA残留肿瘤区域处于高游离脂肪酸（FA）环境，肿瘤细胞大量摄取脂肪酸（如油酸OA），并以脂滴形式储存。同时，脂肪酸氧化（FAO）代谢保持稳态，以维持能量平衡和减少活性氧（ROS）产生。这种脂代谢适应对中性粒细胞功能至关重要：用45°C+OA处理的肿瘤细胞条件培养基培养中性粒细胞，能最强效地诱导NETs形成，而抑制TG合成（使用DGAT1抑制剂PF-04620110）则削弱了这一效应。

PPARγ与P38 MAPK的交互作用调控NETs形成

机制上，研究人员发现PPARγ是残留肿瘤细胞脂代谢重编程的核心调控因子。热和脂肪酸双重刺激下，PPARγ被激活，进而上调其下游靶基因CD36、FABP4和FABP5的表达，这些基因分别负责脂肪酸的摄取和转运。沉默PPARγ或使用其抑制剂T0070907，能显著抑制脂肪酸摄取和脂滴形成。有趣的是，脂质积累又反过来激活了P38 MAPK信号通路。P38的激活进一步促进了炎症因子CXCL5的分泌。在TCGA数据库结直肠癌患者中，P38通路活化与中性粒细胞浸润程度呈正相关，且P38高/中性粒细胞高浸润的患者预后更差。抑制P38信号通路，无论是在体外还是在小鼠体内，都能有效减少NETs形成和肺转移。

P38 MAPK-CXCL5-pERK轴介导NETs形成

CXCL5是中性粒细胞强有力的趋化因子。研究发现，iRFA残留肿瘤细胞通过P38通路分泌大量CXCL5。外源性添加CXCL5能促进中性粒细胞形成NETs，而抑制P38或CXCL5的受体CXCR1/2（使用Reparixin）则能阻断此效应。进一步机制探索表明，CXCL5通过激活中性粒细胞内的MEK/ERK信号通路，特别是增加ERK磷酸化（pERK），来最终触发NETs的释放。在动物模型中，联合使用P38抑制剂（Ralimetinib）和MEK抑制剂（Trametinib）在抑制肺转移方面显示出协同效应。

CD36^hi-EM-CTC检测助力iRFA早期识别

如何早期发现哪些患者经历了iRFA是一个临床挑战。研究人员对13例接受RFA的CRLM患者外周血进行循环肿瘤细胞（CTC）分析。他们定义了一类具有上皮-间质（EM）表型且CD36高表达的CTC亚群（CD36^hi-EM-CTCs）。结果显示，iRFA患者术后外周血中CD36^hi-EM-CTCs数量和NETs标志物（MPO-dsDNA）水平显著高于术前，也高于达到cRFA的患者。这表明CD36^hi-EM-CTCs结合NETs检测，有望成为早期、无创识别iRFA和预测转移风险的有效工具。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了iRFA后肿瘤进展的恶性循环：亚致死热刺激与高脂微环境共同诱导残留肿瘤细胞发生PPARγ介导的脂代谢适应，通过激活P38 MAPK信号增加CXCL5分泌；CXCL5招募并“教育”中性粒细胞，使其分化为促转移的CD177^hiPAD4^hi亚型，通过MEK/ERK依赖的NETs形成，最终促进肺癌转移。同时，研究创新性地提出了CD36^hi-EM-CTC作为早期监测iRFA的生物标志物。

这项研究的发现具有重要的理论和临床意义。首先，它深化了对肿瘤局部治疗后代谢-免疫恶性循环的认识，将肿瘤代谢适应与中性粒细胞介导的炎症反应紧密联系起来。其次，它揭示了CD177^hiPAD4^hi中性粒细胞这一关键效应细胞亚群及其功能，为靶向免疫微环境提供了新的切入点。针对Pad4、P38、MEK/ERK或CXCR1/2的抑制剂，尤其是联合策略，有望成为预防iRFA后转移的潜在疗法。最后，CD36^hi-EM-CTC的发现为临床实现iRFA的早期识别和干预提供了可行手段，有助于对高风险患者进行分层管理和及时补救治疗，从而最终改善CRLM患者的预后。该研究为理解并克服肿瘤局部治疗抵抗提供了全新的视角和策略。