噬菌体编码DNA结合蛋白ORF55激活细菌逆转录酶DRT4抗病毒防御机制的结构与功能研究

《Nature Communications》：Anti-phage defense mechanism involving phage-encoded DNA binding protein and bacterial reverse transcriptase DRT4

本研究针对细菌防御相关逆转录酶（DRT）系统抗噬菌体分子机制不清的问题，聚焦单基因防御系统DRT4，通过结构生物学与生物化学手段，揭示了其以蛋白引发方式合成随机序列单链DNA（ssDNA）的独特机制，并发现噬菌体T5编码的DNA结合蛋白ORF55通过保护ssDNA 3'末端免遭宿主核酸酶降解而激活DRT4免疫反应，导致细胞程序性死亡。该研究发表于《Nature Communications》，阐明了DRT4介导的流产感染新范式，为理解原核生物逆转录酶依赖的防御系统提供了重要见解。

　　

在地球上无处不在的噬菌体，是细菌面临的最主要捕食者。在这场持续了数十亿年的军备竞赛中，细菌演化出了纷繁复杂的防御系统来抵抗病毒的入侵。其中，逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）——这种我们更熟悉其在真核生物逆转录病毒中作用的酶，在原核生物中也扮演着重要的防御角色。防御相关逆转录酶（Defense-associated Reverse Transcriptase, DRT）系统就是一类新发现的、由逆转录酶介导的抗噬菌体系统，但其具体的工作机制，尤其是它们如何被噬菌体感染激活并最终保护细菌群体，在很大程度上仍是一个谜团。

此前的研究已将DRT系统分为多个类型（DRT1-DRT9），其中DRT2系统的机制研究较为深入，它通过非编码RNA（ncRNA）作为模板合成串联cDNA，最终产生毒性蛋白来抑制噬菌体复制。然而，对于像DRT4这样的单基因防御系统，其酶活特性、三维结构以及激活机制均属未知。为了解决这些问题，并深入理解细菌利用逆转录酶进行免疫防御的普遍规律，来自中国科学院武汉病毒研究所邓增钦研究员团队的研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员综合运用了结构生物学、生物化学、微生物遗传学等多种技术方法。关键实验技术包括：利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了DRT4及其与底物/产物复合物的高分辨率结构；通过分析超速离心（AUC）分析蛋白质的寡聚状态；进行体外聚合酶活性测定以表征其酶学特性；通过噬菌斑实验、液体培养生长曲线、菌落形成单位（CFU）计数和荧光显微镜（PI染色）评估抗噬菌体活性和细胞死亡情况；采用RNA测序（RNA-seq）筛选噬菌体激活因子；利用电泳迁移变动实验（EMSA）和微量热泳动（MST）分析蛋白质-核酸相互作用；通过MBP pull-down和免疫印迹（Western Blot）验证蛋白质间相互作用及体内ssDNA积累。

功能表征DRT4

研究人员首先证实，来自大肠杆菌的DRT4能够有效防御噬菌体T5的感染，而其催化活性位点突变体（D240A/D241A）则完全丧失保护能力。纯化的野生型DRT4与核酸共纯化，并形成约418 kDa的寡聚体。生化分析表明，DRT4能以模板非依赖的方式合成单链DNA（ssDNA），该活性需要二价金属离子（如Mg²⁺、Mn²⁺），且合成的DNA产物与蛋白质共价连接。高通量测序显示，这些ssDNA产物具有随机序列，平均长度超过60个核苷酸。

DRT4组装为三聚体二聚体

通过高分辨率（2.27 ?）冷冻电镜结构分析，发现DRT4形成一个六聚体结构，由两个背对背堆叠的三聚体构成，具有D3对称性。每个DRT4单体包含一个经典的逆转录酶“右手”结构（手指和手掌亚结构域），但其拇指亚结构域被一个α螺旋HEAT样重复结构域（aRep domain）所取代。结构揭示了稳定寡聚体的两个关键界面，破坏这些界面的突变会损害DRT4的寡聚化、酶活性和抗噬菌体功能。

DRT4与DNA产物的相互作用

在底物（dNTPs）和Mn²⁺存在下解析的DRT4结构（2.93 ?）揭示了其活性位点的金属离子配位、底物识别以及DNA产物结合模式。结构显示DRT4对dNTP底物的结合具有混杂性，与DNA产物的相互作用也无序列特异性，这从结构上解释了其合成随机序列ssDNA的能力。关键残基的突变实验证实了这些相互作用对其酶活性和防御功能至关重要。

DRT4的DNA合成依赖于蛋白引发

生化证据表明DRT4的DNA合成不依赖于核酸引物。冷冻电镜密度图显示，DNA产物的5'端与Tyr125残基相连。将Tyr125突变为苯丙氨酸（Y125F）后，DRT4完全丧失了抗噬菌体活性、核酸结合能力以及DNA聚合酶活性。系统进化分析表明Tyr125在174个DRT4同源蛋白中完全保守，从而证实Tyr125是DRT4介导的DNA聚合的蛋白引发位点。

DRT4通过流产感染诱导细胞死亡发挥抗噬菌体功能

通过液体培养生长曲线、CFU计数以及碘化丙啶（PI）染色实验，研究人员证实DRT4通过流产感染（Abortive Infection, Abi）策略介导抗噬菌体防御。在低感染复数（MOI=0.5）下，DRT4提供有效的保护；但在高MOI（=5）下，防御被突破，并且大部分表达DRT4的细胞在感染后120分钟内死亡，表明噬菌体感染触发了DRT4介导的宿主细胞自杀。

噬菌体编码的DNA结合蛋白ORF55触发DRT4免疫

由于DRT4本身表达对宿主无毒，其免疫激活必然依赖于噬菌体因子。通过感染后转录组分析，研究人员筛选出61个在感染后期上调的噬菌体T5基因，并发现其中ORF55与DRT4共表达时，能特异性抑制宿主细胞生长，而两者单独表达均无毒性。生物信息学分析和结构预测表明ORF55是一个DNA结合蛋白，其推测的DNA结合残基（Tyr16, Tyr18, Tyr62, Lys63）的突变削弱或消除了其与DRT4共表达时的细胞毒性。EMSA和MST实验证实ORF55能以纳摩尔级的亲和力非特异地结合各种ssDNA同聚物。

ORF55保护DRT4合成的ssDNA

鉴于体外纯化的DRT4仅共价连接短寡核苷酸，而体外反应却能生成长ssDNA，研究人员推测宿主核酸酶可能降解了DRT4的产物。实验发现，大肠杆菌3‘-5' ssDNA核酸外切酶ExoI（由sbcB基因编码）能够降解DRT4合成的ssDNA，而ORF55能以浓度依赖的方式抑制ExoI的降解活性，但对核酸内切酶S1的活性无影响。更重要的是，在sbcB基因敲除的大肠杆菌中表达DRT4会导致明显的生长抑制，而催化失活的DRT4突变体则无此效应。这些结果支持了一个模型：在未感染细胞中，ExoI持续降解DRT4合成的ssDNA；噬菌体T5感染后，其编码的ORF55蛋白与ExoI竞争结合ssDNA的3‘末端，保护ssDNA不被降解，从而导致有毒ssDNA的积累。

DRT4合成的ssDNA介导DRT4与ORF55的相互作用

MBP pull-down实验表明，预先与dNTPs孵育从而合成长ssDNA的野生型DRT4能与ORF55强结合，而催化失活的DRT4突变体（D240A/D241A）或ssDNA结合能力减弱的ORF55突变体（Y18A）则相互作用减弱或消失。这表明是DRT4合成的ssDNA，而非DRT4蛋白本身，介导了与ORF55的结合。免疫印迹分析进一步显示，在噬菌体T5感染过程中，Flag标记的DRT4蛋白会出现高分子量的条带（>250 kDa），这对应于共价连接了长ssDNA的DRT4复合物，且该条带随着感染进程而增强，证实了体内确实发生了ssDNA的积累。

保守的免疫激活机制

研究人员进一步发现，与DRT4结构同源（序列同一性23%）、同样属于I类UG/Abi RT的DRT6，也具有模板非依赖的DNA聚合酶活性，并能被ORF55激活，在sbcB敲除菌株中也表现出生长毒性。这表明ORF55触发的毒性ssDNA积累从而导致流产感染的免疫激活机制，在相关的DRT系统（如DRT4和DRT6）中是保守的。

综上所述，本研究揭示了DRT4介导的抗噬菌体防御的全新机制。在正常情况下，以六聚体形式存在的DRT4持续合成ssDNA，但被宿主核酸酶（如ExoI）降解，对细胞无害。一旦噬菌体入侵，其编码的DNA结合蛋白ORF55便作为“触发器”，通过结合并保护DRT4所合成ssDNA的3‘末端，使其免遭降解，最终导致有毒ssDNA的积累，引发细胞程序性死亡，从而通过牺牲被感染的个体来保护细菌群体。这项工作不仅首次阐明了DRT4的结构基础、独特的蛋白引发机制以及其免疫激活通路，还将噬菌体蛋白ORF55鉴定为关键的防御系统激活因子，建立了一种由噬菌体编码因子触发宿主防御的独特范式。该研究极大地增进了我们对原核生物中逆转录酶多样性功能的理解，并为探索其他Abi-RT系统的激活机制提供了新的思路。鉴于DRT系统在多种人类病原菌中广泛存在，这些发现对开发新型抗菌策略也可能具有潜在意义。