基于液体覆盖技术的三维细胞培养面板开发及其在药物筛选中的应用研究

《Scientific Reports》：Development of a liquid overlay-based three-dimensional cell culture panel for drug screening applications

本研究针对传统药物临床前筛选模型预测性不足的难题，开发了一种基于液体覆盖技术（Liquid Overlay Technique）的标准化三维（3D）细胞培养面板。研究人员通过优化细胞浓度（200–10,000细胞/孔）与基质比例（0–3%），成功构建了涵盖黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、非肿瘤性乳腺及健康肾脏组织的6种球体模型，并利用扫描电子显微镜（SEM）和代谢活性分析验证其结构及功能。研究证实，该面板可灵敏评估奥拉帕利（Olaparib）、卢卡帕利（Rucaparib）和尼拉帕利（Niraparib）等PARP抑制剂的细胞静态与细胞毒性效应，尤其对BRCA1突变模型呈现特异性响应。该方法具有高重现性、自动化分析兼容性及跨组织适用性，为提升药物疗效预测准确性、减少动物实验提供了可靠平台。

　　

药物开发是一场漫长而昂贵的征程，超过一半的候选药物在临床试验的后期阶段折戟沉沙。传统的二维（2D）细胞培养虽操作简便，却因缺乏细胞间相互作用和三维结构，难以模拟体内真实的药物渗透与毒性反应，导致临床前数据预测性不足。与此同时，科学界对动物实验伦理的日益关注（如“3R原则”强调减少、优化和替代动物实验）也推动着新型体外模型的革新。三维（3D）细胞培养技术应运而生，它能够更好地模拟实体组织的生理环境，包括氧分、营养梯度以及药物扩散过程，但其应用始终受限于方法标准化缺失导致的实验结果波动大、可比性差。

在此背景下，一篇发表于《Scientific Reports》的研究论文提出了一种解决方案。研究人员致力于开发一种简单、经济、高效且可标准化的3D细胞培养策略，以期获得高度预测性的药物疗效数据。

本研究的关键技术方法主要包括：采用液体覆盖技术于超低吸附（ULA）96孔板中生成球体；通过明场成像动态监测球体生长曲线；使用活/死细胞染色试剂盒评估球体活性；利用刃天青（resazurin）检测法量化细胞代谢活性；借助扫描电子显微镜（SEM）观察球体表面超微结构；并应用上述模型评估三种PARP抑制剂（奥拉帕利、卢卡帕利、尼拉帕利）的细胞静态（抑制生长）和细胞毒性效应。

结果

球体形成的最佳条件

研究团队为六种细胞系（A-375黑色素瘤、NCI-H1417小细胞肺癌、NCI-H1975非小细胞肺癌、SK-OV-3卵巢癌、MCF-10A非肿瘤性乳腺、VERO 76健康肾脏）系统测试了四种细胞浓度与四种基质（Geltrex）百分比组合。筛选标准包括：每孔形成单个规则球体、第14天直径≥500微米、具备增殖能力（第14天与第1天直径比值D14/D1>1）以及高活性。最终确定了各模型的最佳培养条件，例如A-375为200细胞/孔与2%基质，NCI-H1417为1000细胞/孔与1-3%基质等。明场成像显示，无基质条件常导致细胞分散，而3%基质易产生卫星球体，1-2%基质浓度最利于形成单一、紧凑的球体。

球体直径

生长动力学曲线显示，不同细胞系的最佳增殖条件各异。例如，A-375模型在低细胞浓度（200细胞/孔）与基质结合时D14/D1比值最高（约3.5），而MCF-10A模型则需要较高细胞浓度（5000细胞/孔）才能达到所需尺寸。无基质条件下的生长曲线常因球体解聚而产生偏差。

球体活性

活/死细胞染色结果表明，所有最佳条件下的球体均由活细胞（绿色）和死细胞（红色）组成，高细胞密度区域呈现黄染色（荧光重叠）。高度增殖的癌细胞球体（如A-375）中心可见坏死区域，这与3D培养中常见的营养剥夺现象一致。低细胞浓度形成的球体往往具有更高的活/死细胞比率。

球体代谢活性

刃天青检测显示，各模型在最佳条件下的代谢活性无显著差异，表明形成的球体均具有旺盛的代谢功能。这为后续药物敏感性测试提供了可靠的量化基础。

扫描电子显微镜观察球体形态

SEM分析揭示了不同模型的特异性表面结构。A-375黑色素瘤和NCI-H1417小细胞肺癌球体表面存在较多游离细胞，暗示其潜在的侵袭性；而NCI-H1975非小细胞肺癌、SK-OV-3卵巢癌和VERO 76肾脏球体则被基质完全包裹，形态规则；MCF-10A乳腺球体表面细胞紧密堆积，类似腺体组织。这些形态特征与各组织来源的临床病理特性相符。

抗癌药物PARP抑制剂评估

为验证面板的实用性，研究选取了BRCA1突变的三阴性乳腺癌模型SUM1315（对PARP抑制剂敏感）、BRCA1野生型卵巢癌模型SK-OV-3和非肿瘤性乳腺模型MCF-10A，测试了三种PARP抑制剂（奥拉帕利、卢卡帕利、尼拉帕利）在1μM、10μM、50μM浓度下的效应。

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  奥拉帕利：显著抑制SUM1315突变模型的球体大小和代谢活性（50μM时代谢活性降至45.3%），对SK-OV-3模型影响较小，对MCF-10A模型仅在最高浓度有轻微毒性，符合其已知的选择性毒性。
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  卢卡帕利：对SUM1315和SK-OV-3模型均表现出较强的细胞毒性（50μM时代谢活性分别降至10.4%和19.9%），对MCF-10A模型影响较小。
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  尼拉帕利：对三种模型的球体大小均有抑制作用，并对两种癌细胞模型均表现出强细胞毒性，但对非肿瘤模型毒性相对可控。
  结果印证了合成致死效应——PARP抑制剂对BRCA1缺陷细胞具有更强杀伤力，且与部分临床批准适应症一致，同时提示卢卡帕利和尼拉帕利在BRCA突变乳腺癌中的潜在应用价值。

结论与意义

本研究成功建立了一种基于改进液体覆盖技术的标准化3D细胞培养面板。该方案简单、经济、重现性高，能在普通细胞实验室中产生尺寸可控、活性持久（可达14天）的球体，并适用于中通量筛选（MTS）。研究构建的多样化模型面板（涵盖不同组织来源和病理状态的细胞）及其自动化分析流程，显著提升了药物细胞静态和细胞毒性效应评估的预测能力。

尤为重要的是，通过SEM观察到的球体表面形态特征（如侵袭性模型表面的游离细胞）与临床侵袭性潜在关联，以及药物测试结果与临床已知疗效和合成致死理论的高度一致性，充分证明了该3D模型面板在模拟体内微环境及预测药物反应方面的可靠性。

这项工作为改进药物临床前筛选提供了强有力的工具，有助于更准确地预测药效和毒性，从而加速候选药物筛选，并有效减少对动物模型的依赖。未来，通过在该面板中引入成纤维细胞、免疫细胞等构建共培养模型，将进一步增强其模拟肿瘤微环境的复杂性，拓展其在免疫治疗等领域的应用前景。