神经纤毛蛋白-1（NRP1）基因敲低 Claudin-low 三阴性乳腺癌细胞系的大规模RNA测序数据集：探索潜在治疗靶点的转录组学资源

《Scientific Data》：Bulk RNA sequencing dataset of Claudin-low breast cancer cell lines with Neuropilin-1 knockdown

本刊推荐：为探索侵袭性三阴性乳腺癌（TNBC）中Claudin-low亚型缺乏有效靶向治疗的难题，Lynam等人开展了针对关键受体Neuropilin-1（NRP1）的功能研究。研究人员通过siRNA和shRNA在三种Claudin-low细胞系（HS578T、MDA-MB-231、SUM159PT）中敲低NRP1，并进行了大规模RNA测序，生成了包含52个样本的转录组数据集。该数据集揭示了NRP1调控的信号通路，为阐明其在肿瘤进展中的作用及开发靶向疗法提供了宝贵资源，对改善TNBC患者预后具有重要意义。

　　

在乳腺癌的复杂版图中，三阴性乳腺癌（TNBC）因其侵袭性强、预后差且易复发的特点，始终是临床治疗的一大挑战。由于缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达，TNBC患者无法从常规的内分泌治疗和HER2靶向治疗中获益，化疗仍是其主要治疗手段。尽管聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制剂和程序性死亡配体1（PD-L1）免疫疗法为部分携带BRCA突变或PD-L1阳性的患者带来了希望，但仍有大量TNBC患者面临治疗选择有限的困境。在这一严峻背景下，约占TNBC病例25%-39%的Claudin-low亚型因其独特的生物学特性引起了研究人员的极大关注。

Claudin-low乳腺癌的标志是细胞间连接蛋白（如claudin-3, -4, -7和E-钙黏蛋白）的低表达，以及上皮-间质转化（EMT）和癌症干细胞特征的富集。这使得该亚型成为分化最差、最原始的乳腺癌类型之一，其行为类似于乳腺上皮干细胞，并常伴有RAS-MAPK等致癌信号通路的异常激活。因此，深入理解驱动Claudin-low乳腺癌进展的关键分子机制，对于开发新的靶向策略至关重要。

近年来，神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1, NRP1）作为一种多功能跨膜辅助受体，在癌症中的作用逐渐凸显。NRP1不仅参与血管生成、细胞迁移和免疫调节等生理过程，更能与多种生长因子受体（如VEGFR、EGFR、PDGFR）形成二聚体，增强配体结合，从而激活促进肿瘤发生发展的信号通路。先前的研究表明，NRP1在Claudin-low乳腺癌中的表达水平显著高于其他亚型，并且其敲低能有效抑制肿瘤生长和细胞增殖，提示NRP1可能是该亚型的一个关键驱动因子。然而，除了在MDA-MB-231细胞系中的个别研究外，尚缺乏在多株Claudin-low细胞系中系统评估NRP1调控的转录组景观的高通量研究。

为了填补这一空白，由Layla-Rose Lynam、Anja Rockstroh和Melanie Lehman等研究人员组成的团队在《Scientific Data》上发表了题为“Bulk RNA sequencing dataset of Claudin-low breast cancer cell lines with Neuropilin-1 knockdown”的数据论文。该研究通过对三种经典的Claudin-low乳腺癌细胞系（HS578T、MDA-MB-231和SUM159PT）进行NRP1基因敲低，并利用大规模RNA测序技术，构建了一个包含52个样本的综合性转录组数据集。研究人员使用了两种小干扰RNA（siRNA）和两种短发夹RNA（shRNA）序列来敲低NRP1，并设置了相应的非靶向对照。其中，siNRP1#3/shNRP1#3特异性靶向跨膜形式的NRP1，而siNRP1#5/shNRP1#5则能同时靶向跨膜和可溶性NRP1，这种精巧的设计允许研究者区分不同NRP1亚型的功能。该数据集为科学界深入探索NRP1在Claudin-low乳腺癌中的转录调控网络，及其作为潜在治疗靶点的可能性提供了宝贵的资源。

关键技术方法概述

本研究的关键技术流程包括：利用siRNA（脂质体转染）和shRNA（慢病毒转导）分别在HS578T、MDA-MB-231和SUM159PT这三种人源Claudin-low乳腺癌细胞系中进行NRP1基因敲低；使用TRIzol法提取总RNA并经过质量检验（RNA完整性指数RIN>9）；利用Illumina TruSeq Stranded mRNA建库试剂盒进行链特异性polyA富集文库制备；在MGI DNBSEQ-G400平台上进行双端150bp测序，目标测序深度为每样本4000万读长对；使用FastQC、TrimGalore进行原始数据质控和修剪；通过STAR比对软件将质控后的序列比对至人类参考基因组（GRCh38/hg38）；采用RSEM进行转录本和基因水平的定量；并利用Kraken2筛查微生物污染。后续数据分析包括使用R软件包edgeR进行TMM归一化，以及多维标度分析等。

研究结果

NRP1敲低的有效性验证

在提交测序之前，研究人员通过RT-qPCR验证了NRP1敲低效率。结果表明，在大多数情况下，siRNA和shRNA处理样本中的总NRP1表达量相较于其各自的非靶向对照均显著降低。值得注意的是，在HS578T细胞中，siNRP1#3处理组的NRP1水平仅轻微下降，与对照几乎无差异。考虑到siNRP1#3/shNRP1#3序列设计为特异性靶向跨膜NRP1，研究人员推测可溶性NRP1的表达可能影响了总NRP1的敲低水平。为此，他们设计了特异性检测跨膜NRP1的引物进行验证，结果证实跨膜NRP1在所有细胞系中均被有效抑制，从而验证了敲低策略的特异性。

测序数据质量评估

对测序数据进行的严格质控显示，所有样本的GC含量均一，约为50%。序列比对分析表明，约85%至95%的读长能够唯一比对到人类参考基因组，显示出高质量的数据产出。利用Kraken2对未比对到人类基因组的读长进行微生物污染筛查，结果显示所有样本中仅存在低水平的细菌、真核生物、病毒或古菌污染，并且支原体污染水平极低（<3 CPM），证实了细胞培养的无污染状态，进一步保证了数据的可靠性。

样本相似性与差异性分析

通过多维标度分析评估样本间的整体关系发现，样本的聚类主要受细胞系来源驱动，这反映了不同模型之间存在的巨大转录组差异。其次，在第三维度上，样本会根据敲低方式（siRNA vs shRNA）发生分离。在针对每个细胞系单独进行的MDS分析中，可以更清晰地观察到处理组效应。虽然样本聚类并非总是完全分离，但基因水平和转录本水平的分析均显示，样本首先按siRNA和shRNA分组，并且在第二维度上显示出按靶向序列（#3 vs #5）分离的趋势，这表明不同的敲低方法和靶点确实引起了可区分的转录组变化。

NRP1表达与转录本变异分析

对数据集本身NRP1表达的分析证实，在每个细胞系中，siRNA和shRNA处理样本的NRP1基因表达水平均低于其对应的非靶向对照，这与RT-qPCR结果一致，从测序数据层面再次验证了敲低的有效性。对NRP1转录本变异体的分析显示，NRP1-206（编码经典跨膜亚型）和NRP1-204（编码可溶性亚型）的表达百分比最高。值得注意的是，在特异性敲低跨膜NRP1的siNRP1#3和shNRP1#3样本中，编码可溶性亚型的NRP1-204转录本成为主导变异体，这有力地证明了siNRP1#3/shNRP1#3序列仅特异性敲低跨膜NRP1，而不影响可溶性NRP1的表达，凸显了实验设计的精确性。

结论与意义

本研究通过系统性的基因敲低和高通量RNA测序，成功构建并验证了一个高质量的Claudin-low乳腺癌细胞系NRP1敲低转录组数据集。该数据集全面展示了在三种不同Claudin-low模型中敲低NRP1后引发的转录组变化，为深入研究NRP1调控的信号网络（如EMT、RAS-MAPK通路等）提供了坚实的基础。数据的严谨质控和多维度分析确保了其可靠性和可重用性。这一宝贵资源将极大地推动对NRP1在Claudin-low乳腺癌中生物学功能的认知，有助于识别下游关键效应分子和通路，为未来开发针对NRP1或其相关信号轴的靶向治疗策略奠定基础，最终有望为缺乏有效治疗手段的Claudin-low TNBC患者带来新的希望。该数据集已公开存放于NCBI基因表达综合数据库，登录号为GSE266566，便于全球研究人员访问和挖掘。