《Waste Management》：Non-ionic detergent-based screening method for poly (butylene adipate-co-terephthalate) (PBAT)-degrading microorganisms
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聚丁二酸-对苯二甲酸共聚酯（PBAT）降解微生物的筛选方法优化研究，比较了8种表面活性剂对透明圈测试的影响，发现非离子表面活性剂Tween 20能快速形成清晰透明圈并有效筛选出Bacillus sp. Y4（14天降解率52%），该方法亦适用于其他生物可降解塑料。
韩艺彬|吴珍玉|金艺妍|全正民|朴白洙|尹正俊|沙希·坎特·巴蒂亚|杨永勋
韩国庆北大学工程学院生物工程系先进材料项目，首尔05029
摘要
由于生物塑料对环境的影响较小，其使用量不断增加，因此人们对能够降解生物塑料的微生物的兴趣也随之增加。为了筛选这类微生物，人们广泛采用了一种基于含有生物塑料乳液和洗涤剂的平板的透明圈测试方法，这种方法能够快速准确地识别微生物。尽管乳化洗涤剂会影响微生物的水解活性，但不同洗涤剂对微生物的影响尚未得到全面评估。在本研究中，评估了八种不同洗涤剂在筛选聚丁酸丁二醇酯-对苯二甲酸乙二醇酯（PBAT）降解菌株方面的效果。阴离子洗涤剂月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl NL）、十二烷基硫酸钠（SDS）和非离子聚山梨酯20（Tween 20）能够促进透明圈的形成。其中，基于Tween 20的透明圈测试系统在筛选PBAT降解菌株方面最为有效，能够快速形成明显的透明圈。该方法同样适用于聚丁酸琥珀酸酯（PBS）、聚己内酯（PCL）和聚乳酸（PLA）。利用基于Tween 20的方法，分离出了Bacillus sp. Y4菌株，该菌株在14天内的PBAT降解率为52%。总体而言，本研究表明基于Tween 20的透明圈检测方法是一个可靠且生物稳定的筛选平台。
引言
随着现代化和工业化的发展，对塑料的需求持续增加，导致传统塑料的积累引发了严重的环境污染（Houssini等人，2025年；Iroegbu等人，2021年），而生物塑料作为传统塑料的替代品越来越受到关注（Ortiz，2023年；Terzopoulou和Bikiaris，2024年）。这些材料可以减轻传统塑料对环境的负担，并被应用于包装、一次性产品、医疗设备和农业等多个行业（Bhatia等人，2019b年）。因此，全球范围内可生物降解塑料的使用量稳步增长，其工业应用范围也在不断扩大（Hu和Zhou，2024年）。
在生物塑料中，聚丁酸丁二醇酯-对苯二甲酸乙二醇酯（PBAT）是一种商业上广泛使用的可生物降解塑料，因其具有优异的机械强度和柔韧性（Gu，2021年）。然而，由于其结构特性和芳香族成分的存在，其在自然环境中的降解速率较低（Hu等人，2022年；Roy等人，2024年）。特别是来自对苯二甲酸的酯键具有很高的化学稳定性，这阻碍了微生物的降解（Hu等人，2022年；Roy等人，2024年）。尽管已有许多菌株被报道能够降解PBAT，但迄今为止大多数单一菌株的降解效率较低，降解时间较长，或者需要特定的环境条件才能有效降解PBAT。例如，Stenotrophomonas sp. YCJ1在5天内的降解率为10.1%（Jia等人，2021年），而Bacillus pumilus在10天内的降解率为6%（Muroi等人，2017年）；Bacillus JO01在21天内的降解率为61%（Oh等人，2024年）；Bacillus JY35在21天内的降解率为50%（Cho等人，2022年）。尽管一些Bacillus菌株表现出显著的PBAT降解能力，但PBAT仍然是一种难以降解的聚合物，在常规筛选条件下可能无法检测到许多潜在的降解菌株。因此，改进筛选方法对于发现具有PBAT降解能力的额外菌株具有重要意义。
为实现这一目标，人们提出了多种筛选方法来高效选择PBAT降解菌株。通常，将环境样本涂布在含有塑料乳液或薄膜的固体培养基上，然后对选定的菌落进行液体培养，通过测量薄膜重量损失或气相色谱（GC）定量来评估其降解能力（Tseng等人，2023年；Wufuer等人，2022年）。因此，透明圈测试是一种关键方法，其中乳化的PBAT分散在固体培养基中，通过微生物酶的分泌形成透明圈，从而实现快速准确的筛选（Cho等人，2021年）。然而，由于洗涤剂会影响乳液的稳定性和细胞毒性，因此实验结果可能因使用的洗涤剂类型而异。此前，在本实验室中，主要使用阴离子洗涤剂（如月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl NL）和十二烷基硫酸钠（SDS）来乳化PBAT（Cho等人，2021年；Oh等人，2024年；Shin等人，2024年），这为基于平板的方法提供了许多筛选机会。然而，尽管这些洗涤剂具有很强的乳化能力，但它们可能具有细胞毒性且成本相对较高（Arakawa等人，2024年；Tseng等人，2016年）。此外，目前尚无关于不同洗涤剂对平板上菌株水解活性影响的比较研究。因此，正确选择洗涤剂对于确保透明圈测试的准确性至关重要。基于此，本研究比较了八种常见洗涤剂（包括聚氧乙烯山梨醇单油酸酯（Tween 20）、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯（Tween 80）、聚氧乙烯山梨醇三油酸酯（Tween 85）、Triton X-100、山梨醇月桂酸酯（Span 20）、SDS、Sarkosyl NL和溴化鲸蜡胺（CTAB）在相同条件下的透明圈形成情况，这些洗涤剂与高活性PBAT降解菌株Bacillus sp. JY35进行了对比（Cho等人，2022年）。通过这种比较，确定了适合PBAT乳化的替代洗涤剂，并使用已知的PBAT降解菌株验证了它们在透明圈筛选中的适用性。这些发现表明，替代洗涤剂可以作为寻找不同塑料降解菌株的实用替代品。
化学试剂
本研究使用的所有化学试剂均为分析级或更高级别。HPLC级别的氯仿、甲醇和蒸馏水购自Fisher Scientific（韩国首尔）。硫酸（95.0%）购自Samchun Chemicals（韩国平泽），海洋肉汤（MB）购自Difco（BD Biosciences，美国马里兰州斯帕克斯）。无水硫酸钠（纯度≥99.0%）购自Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.（韩国始兴）。
选择洗涤剂以提高透明圈检测的效果
由于PBAT具有很强的疏水性，如果不进行乳化处理，它无法均匀分散在水性培养基或琼脂平板中（Moustafa等人，2017年）。虽然洗涤剂常用于此目的，但不同类型洗涤剂的效果尚未系统研究。尽管之前的研究中使用了Sarkosyl NL和SDS（Cho等人，2021年；Oh等人，2024年），但它们的强阴离子性质可能会破坏微生物膜并降低细胞活力
结论
本研究强调了在处理生物塑料时选择乳化洗涤剂的重要性，这对于有效和可重复地筛选降解塑料的菌株至关重要。研究发现，使用Tween 20乳化的PBAT进行的透明圈方法是一种经济且对微生物友好的筛选方法。通过Tween 20，可以快速且一致地形成透明圈，从而成功分离出具有潜力的菌株Bacillus sp. Y4。
作者贡献声明
韩艺彬：撰写初稿、数据可视化、数据分析、概念构建。吴珍玉：方法设计、数据分析。金艺妍：结果验证、实验调查。全正民：项目监督、项目管理。朴白洙：结果验证、资源准备、概念构建。尹正俊：数据分析。沙希·坎特·巴蒂亚：数据可视化、数据管理。杨永勋：撰写、审稿与编辑、项目监督、概念构建。
资助
本研究还得到了韩国国家研究基金会（NRF）[RS-2022-NR068488 & NRF-2022R1A2C2003138]和MOTIE/KEIT研发计划[20025698, 02311604及RS-2025-09312968]的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
