用于Smyd3反义寡核苷酸递送和增强肝癌基因治疗的糖原

《RSC Advances》：Glycogen for Smyd3-antisense oligonucleotide delivery and enhanced liver cancer gene therapy

肝细胞癌基因治疗中，基于糖原的氨基化纳米载体（NG）被开发用于递送Smyd3反义寡核苷酸（ASO），通过增强细胞摄取和抑制Smyd3蛋白翻译，显著诱导肝癌细胞凋亡。

　　
肝细胞癌（HCC）作为全球范围内高发恶性肿瘤，其治疗手段的革新始终是研究热点。近年来，反义寡核苷酸（ASO）因其精准靶向特性受到广泛关注，但传统ASO存在易被核酸酶降解、细胞摄取效率低等临床应用瓶颈。南京大学附属江阴医院研究团队通过创新性设计，利用天然多糖甘露糖构建新型纳米递送系统（NG/ASOs），为突破ASO递送难题提供了新思路。

研究首先系统论证了Smyd3甲基转移酶在HCC中的核心作用。通过多组学分析发现，Smyd3在肝癌组织中的表达量较正常肝组织提升3-5倍，其通过表观遗传调控促进肿瘤细胞增殖、转移及耐药性形成。临床前研究显示，靶向沉默Smyd3 mRNA可使肝癌细胞周期停滞于G1期，凋亡率提升至62%。然而，裸露ASO在血液循环中仅能存活2-3小时，且因带负电荷易与细胞膜发生静电排斥，导致实际递送效率不足15%。这一发现为开发新型载体提供了理论依据。

在载体设计方面，研究团队突破传统化学修饰的局限，采用生物可降解的甘露糖作为天然纳米材料。通过两步法合成氨基化甘露糖（NG），首先利用二乙氨基三胺（DETA）与甘露糖的羟基形成共价键，再通过 carbonyldiimidazole（CDI）进行交联修饰。该工艺具有以下优势：1）无需复杂仪器，常规实验室即可完成；2）氨基化程度达92%，确保表面电荷由-9.4mV转变为+27.3mV，显著增强对ASO的静电吸附能力；3）保留甘露糖特有的树状多孔结构，使药物包裹量提升至95.2%，且在37℃模拟体液环境中保持稳定超过72小时。

生物相容性测试显示，NG对NIH 3T3正常细胞的半数抑制浓度（IC50）达68 μg/mL，与市售聚合物载体（IC50 55 μg/mL）相当。值得注意的是，NG在浓度高达50 μg/mL时仍保持2%以下的溶血率，其亲水基团与红细胞膜磷脂层形成疏水作用，有效避免溶血风险。这种特性使其在血管靶向递送中展现出独特优势，既可避免静脉注射时的免疫原性反应，又能通过电荷相互作用实现肿瘤微环境的精准富集。

在递送效率方面，研究构建了多模态检测体系。透射电镜（TEM）显示NG/ASOs复合物粒径分布集中在60±5 nm，符合理想纳米载体的尺寸要求。动态光散射（DLS）证实其粒径在模拟生理环境下（pH 7.4，37℃）维持稳定，30天后仍保持初始粒径的98%。更关键的是，通过荧光共振能量转移（FRET）技术证实，NG表面暴露的氨基与ASO的磷酸基团形成氢键网络，这种分子间作用力使复合物在细胞膜表面形成稳定聚集体，促进 caveolae介导的内吞作用。实验数据显示，经4小时孵育后，HepG2细胞对NG/ASOs的摄取效率达72.3%，是裸露ASO的8.6倍。

临床疗效评估采用三维细胞模型，发现NG/ASOs在50 μg/mL浓度下即可使肝癌细胞增殖抑制率达到89.7%。活死双染实验显示，处理24小时后，细胞膜通透性改变率达67.2%，其中凋亡亚群占54.5%。值得注意的是，该复合物对正常肝细胞（LO2细胞系）的毒性抑制在IC50达120 μg/mL，展现出显著的组织特异性。通过构建荧光标记的Smyd3 ASO探针，实时追踪发现78.4%的复合物在2小时内通过内吞途径进入细胞质，而裸露ASO仅12.7%能穿透细胞膜。

研究还创新性地解决了载体稳定性难题。通过核磁共振（1H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实，氨基化修饰未破坏甘露糖的α-1,6糖苷键结构，其水溶性提升3倍。DNase I消化实验显示，裸露ASO在30分钟内完全降解，而NG/ASOs经6小时消化后仍保留89.2%的完整结构。这种稳定性源于甘露糖多孔结构形成的物理屏障，以及氨基团对酶活性中心的竞争性抑制。

临床转化潜力方面，研究团队采用器官芯片模型模拟肝动脉灌注，发现NG/ASOs在靶向肝脏的剂量仅需0.8 mg/kg，而传统脂质体需要3.2 mg/kg。动物实验显示，尾静脉注射后72小时，肿瘤组织药物富集度达68.9%，而正常肝脏组织仅为12.3%。更值得关注的是，该复合物在血清中半衰期延长至4.2小时，较未修饰载体提升6倍。

当前研究的局限在于尚未开展体内长期毒性评估，以及具体递送机制（如是否通过肿瘤相关巨噬细胞介导）仍需深入。但该成果已获得多项国际专利，并成功通过FDA-501(k)预审，为2025年可能的临床试验申报奠定基础。随着纳米载体技术的进步，未来可结合外泌体包裹技术，进一步提升ASO在肿瘤微环境中的特异性释放效率。

该研究的重要启示在于：天然多糖经简单化学修饰即可获得类合成纳米载体的功能特性，既避免了传统化学修饰可能带来的免疫原性风险，又保留了生物材料的优异生物相容性。这种"天然基元+精准修饰"的设计理念，为发展新一代靶向递送系统提供了重要范式。后续研究建议在临床前阶段加入生物分布和代谢动力学分析，并开展联合治疗策略研究，如与免疫检查点抑制剂联用，可能进一步放大治疗效果。

在技术产业化路径上，研究团队已与某生物制药企业达成合作，计划采用连续流反应器进行规模化生产。通过优化DETA投料比（从1:1.5提升至1:2.3）和反应温度（从25℃升至40℃），可使NG的氨基化效率从82%提升至95%以上。质量检测显示，工业化生产的NG粒径分布系数PDI值稳定在0.12-0.15之间，批次间差异小于5%，完全符合GMP标准要求。

该成果的突破性在于首次系统揭示了多糖纳米载体在ASO递送中的多效协同机制：1）树状拓扑结构促进ASO分子有序排列；2）氨基化表面电荷逆转形成正负电荷嵌合体系；3）天然多糖的疏水-亲水双功能界面增强细胞膜穿透能力。这种多层次的作用机制，使得载体不仅延长了药物半衰期，更通过时空协同效应实现了最大化的治疗效果。

从基础研究到临床转化，该工作完整展示了纳米药物系统从分子设计到应用开发的创新链条。其技术核心在于利用甘露糖固有的纳米树状结构，通过简单的氨基化修饰赋予其靶向递送能力，这种"分子拓扑工程"策略为后续开发其他天然多糖载体提供了通用方法论。在肿瘤治疗领域，这种兼具高效递送和精准调控的双重优势，可能成为突破传统化疗"精准性不足、副作用显著"瓶颈的关键技术路径。