《Neuropharmacology》：Analgesic effect of cinobufagin is mediated by human-selective P2X7R antagonism governed by distinct extracellular domains
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慢性疼痛管理面临现有药物疗效与安全性不足的挑战。本研究发现天然产物cinobufagin（CBG）作为新型人类选择性P2X7受体拮抗剂，通过阻断远端胞外域F103/M105残基介导的神经炎症信号通路，显著抑制小鼠 Freund's完全佐剂诱导的炎症性疼痛，且对其他疼痛相关离子通道无显著影响。
余克欣|李敏|金宇晨|赵淼|王泽良|余海波
摘要：
慢性疼痛的管理仍然是一个重大的临床挑战，这主要是由于现有镇痛药的效果和安全性有限。P2X7受体（P2X7R）作为神经炎症信号传导的关键调控因子，是一个有前景的治疗靶点；然而，P2X7R拮抗剂的临床进展受到了其疗效有限以及药理活性存在显著物种差异的阻碍。在本研究中，我们发现cinobufagin（CBG）是一种新型的人类选择性P2X7R别构拮抗剂。CBG在测量YO-PRO-1摄取、钙流和电生理反应的功能实验中显著抑制了人类P2X7R的活性，但对大鼠P2X7R或其他P2X亚型几乎没有作用。结构建模和突变分析证实CBG与P2X7R的典型别构口袋结合，其中F103和M105残基对于结合至关重要。值得注意的是，这种物种选择性并非由结合口袋本身的变化决定，而是由远端细胞外域决定的。我们进一步确定了R126、S165、I170、R270、Y288和N303等残基是这种选择性的关键分子决定因素。在完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎症疼痛小鼠模型中，CBG表现出显著的镇痛效果。全面的电生理分析也证实了其对其他主要疼痛相关离子通道的选择性。总体而言，我们的工作阐明了CBG的作用机制，并揭示了P2X7R的别构调节可以受到远端细胞外域远距离构象影响的作用机制，而不仅仅是由配体与口袋的直接相互作用决定的。
引言
慢性疼痛影响了全球超过30%的人口，严重降低了生活质量，并给医疗系统带来了巨大的经济负担（Cohen等人，2021年；Zhao等人，2023a）。其病因涉及周围组织损伤、慢性炎症或适应性病理变化，导致一种以复杂的神经免疫相互作用为特征的持续状态（Descalzi等人，2015年）。这种复杂性使得开发单一靶点疗法变得特别困难（Abrahamsen等人，2008年；Dray，2008年）。此外，传统的药物治疗方法如阿片类药物和非甾体抗炎药往往受到安全问题和长期疗效不足的限制，因此需要探索替代性的机制（Sriram等人，2025年）。
嘌呤能P2X7受体（P2X7R）是一种ATP门控的阳离子通道，在中枢和周围神经系统中的免疫细胞中作为炎症小体激活的关键介质而受到关注。在炎症条件下，细胞外ATP水平升高会激活P2X7R，触发包括细胞因子释放和免疫细胞激活在内的促炎反应级联（Di Virgilio等人，2017年；Giuliani等人，2017年；Sluyter，2017年）。作为神经炎症级联的上游调节因子，P2X7R是一个有前景的治疗靶点，有可能打破神经炎症和疼痛敏感化的自我维持循环（Dai等人，2022年；Di Virgilio等人，2017年；Illes，2020年；Zhao等人，2023b）。重要的是，P2X7R的激活需要病理学上高水平的ATP（>100 μM），远高于生理水平（nM范围），这可能通过将其活性限制在疾病状态下而带来有利的安全性（Bhattacharya和Biber，2016年）。
遗传学证据进一步支持了P2X7R在疼痛发病机制中的作用。P2X7R敲除小鼠在炎症和神经病理性疼痛模型中表现出较低的疼痛敏感性（Chessell等人，2005年），某些人类多态性（例如H155Y、A348T）与疼痛敏感性改变有关（Ursu等人，2014年）。尽管许多P2X7R拮抗剂在临床前研究中显示出良好的疗效（Honore等人，2006年；Park等人，2015年），但它们的临床转化大多不成功——例如AZD9056和CE-224,535在二期试验中失败（Keystone等人，2012年；Stock等人，2012年）。导致这一转化差距的一个主要因素是P2X7R抑制剂明显的物种依赖性药理学特性，这使得将啮齿动物数据外推到人类变得复杂。因此，开发新型P2X7R阻滞剂并弥合临床前模型与临床结果之间的差距仍然是紧迫的任务。
在这项研究中，我们旨在寻找具有更好转化潜力的新型P2X7R抑制剂。通过系统的筛选方法，我们发现cinobufagin（CBG）是一种强效且选择性作用于人类的P2X7R拮抗剂。我们采用了一种多学科策略，结合功能筛选、电生理学、分子对接和定向突变来：（1）表征CBG对P2X7R的拮抗活性和物种选择性；（2）确定其结合模式并阐明其人类选择性的结构决定因素；（3）在小鼠炎症疼痛模型中评估其镇痛效果。此外，我们还评估了CBG对其他主要疼痛相关离子通道的选择性，以定义其药理特性。我们的发现表明CBG是一种新型的人类选择性P2X7R拮抗剂，并且更重要的是，揭示了一组远端细胞外残基通过别构作用调控其物种选择性的机制——这一机制将结合位点与选择性决定因素分离，为理解该受体的物种依赖性药物作用提供了新的框架。
材料
Cinobufagin（CBG，纯度≥98%）购自J&K Scientific（中国北京）。Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2’,4’-disulfonic acid（PPADS）从GLPBIO（美国）购买，而capsaicin、ATP-Na2、YO-PRO-1、GABA和poly-D-lysine则购自Sigma-Aldrich（中国上海）。对于电生理实验，化合物被制备成30 mM的储备溶液，并在实验当天稀释至工作浓度，最终的DMSO浓度不超过...
CBG在筛选中对P2X7R介导的染料摄取表现出物种特异性的抑制作用
嘌呤能P2X7受体（P2X7R）在持续刺激下不会发生脱敏，表现出持续的激活（McCarthy等人，2019年）。其长时间的刺激会导致形成可渗透染料的巨孔，允许分子大小达到约900 Da的分子通过（Karasawa等人，2017年），从而引发炎症反应和细胞死亡（Di Virgilio等人，2018年）。YO-PRO-1是一种优选的荧光探针，可以通过染料摄取实验高效筛选P2X7R拮抗剂（Cuthbertson等人，2022年；...
讨论
尽管经过数十年的治疗开发，现有的镇痛药在打破慢性疼痛发病机制中的神经免疫相互作用方面仍然效果不佳（Descalzi等人，2015年；Dray，2008年）。P2X7受体（P2X7R）由于其在中枢和周围神经系统神经炎症级联中的上游作用（Di Virgilio等人，2017年；Illes，2020年）以及其在生理条件下的功能性静息状态下的良好安全性（Bhattacharya和Biber，2016年），成为一个有前景的治疗靶点。
CRediT作者贡献声明
余克欣：撰写原始稿件、方法学设计、实验研究、数据分析。余海波：审稿与编辑、撰写原始稿件、项目管理、资金申请。金宇晨：资源提供、方法学设计。李敏：方法学设计、实验研究。王泽良：软件使用、资源协调。赵淼：软件使用、资源协调
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
利益冲突声明
作者声明他们没有可能影响本研究结果的竞争性利益或个人关系。所有作者在研究进行时都是独立的，且没有潜在的竞争性利益可能影响结果的解释或发表过程。
致谢
本研究得到了中国医学科学院创新基金（CAMS Innovation Fund for Medical Sciences，编号2021-I2M-1-029）和北京新药机制与药理评价研究重点实验室（项目编号：BZ0150）的支持。
