室温条件下Isoxazolyl Penicillins与A类β-内酰胺酶CTX-M-14的结合模式研究

《Communications Chemistry》：Binding mode of Isoxazolyl Penicillins to a Class-A β-lactamase at ambient conditions

本刊推荐：为阐明革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制，研究人员利用室温连续同步辐射晶体学技术，首次解析了临床重要β-内酰胺酶CTX-M-14 E166A突变体与三种异恶唑基青霉素（Oxacillin、Cloxacillin、Dicloxacillin）的酰基-酶中间体结构。研究发现，尽管三种抗生素仅相差1-2个氯原子，但其苯环氯代程度增加会导致构象异质性增强，并通过破坏Ω环与α/β结构域间的氢键诱导活性中心扩张。该研究为开发针对超广谱β-内酰胺酶的新型抑制剂提供了结构基础。

　　

在抗生素与细菌的军备竞赛中，β-内酰胺类抗生素作为人类最有力的武器之一，正面临严峻挑战。革兰阴性菌通过产生β-内酰胺酶（β-lactamases）这一"智能武器"，能够水解β-内酰胺环，使抗生素失效。其中，CTX-M型超广谱β-内酰胺酶（ESBL）已成为全球范围内最成功的耐药机制之一，而CTX-M-14更是其中的"明星分子"。然而令人惊讶的是，尽管异恶唑基青霉素（Isoxazolyl Penicillins）如Oxacillin、Cloxacillin和Dicloxacillin自20世纪70年代就已投入使用，科学界却从未在原子水平上看清它们与A类β-内酰胺酶的相互作用方式。这一知识空白严重制约了针对耐药菌的新药研发。

为了解决这一难题，由德国汉堡大学医学中心Gargi Gore、Andreas Prester、David von Stetten、Kim Bartels和Eike C. Schulz组成的研究团队，在《Communications Chemistry》上发表了突破性研究。他们独辟蹊径，采用室温连续同步辐射晶体学（SSX）技术，首次解析了CTX-M-14 E166A突变体与三种异恶唑基青霉素的复合物结构，揭示了这些抗生素在近生理温度下的真实结合模式。

研究的关键技术方法包括：利用催化受损的CTX-M-14 E166A突变体捕获酰基-酶中间体；通过固定靶序列晶体学在20°C条件下收集衍射数据；使用环境控制系统维持98%相对湿度防止晶体脱水；采用CrystFEL软件包处理序列衍射数据，并通过分子置换和迭代精修获得高分辨率结构。

共享的异恶唑基青霉素活性中心相互作用

研究人员在约1.7?分辨率下获得了三种复合物的晶体结构。所有配体均通过催化残基Ser 70形成共价连接，并与保守残基（Ser 70、Asn 104、Ser 130、Asn 132、Asn 170、Thr 235和Ser 237）形成氢键网络。特别值得注意的是，β-内酰胺羰基与Ser 70和Ser 237的主链氮原子形成2.8-3.0?的氢键，这一特征在所有复合物中均高度保守，被认为能够稳定酰化步骤中四面体中间体产生的负电荷。

CTX-M-14中独特的Oxacillin结合模式

与先前解析的OXA-1（Class D）β-内酰胺酶中的Oxacillin结合模式相比，CTX-M-14中的Oxacillin呈现出显著不同的空间取向。其3-苯基-5-甲基异恶唑部分朝向Pro 167，而在其他类别β-内酰胺酶中该基团旋转了90-150°。这一差异可能源于A类酶独特的活性中心结构，或是室温数据采集捕获了更真实的构象集合。

CTX-M-14中两种不同的Cloxacillin构象

Cloxacillin的电子密度图显示，其2-氯苯环存在两个明确构象，主要构象占75%，次要构象占25%。这种构象异质性在先前低温结构中未被观察到，可能源于室温条件下氯苯环绕C-C键的旋转自由度增加。

CTX-M-14中三种不同的Dicloxacillin构象

Dicloxacillin表现出最复杂的构象异质性，研究人员成功建模了三个独立构象（占有率分别为39%、39%和22%）。有趣的是，其中一个构象类似于Oxacillin，另一个则与Cloxacillin相似，表明二氯苯基的引入显著增加了构象灵活性。氯原子与活性中心残基（如Asn 104、Asn 170、Asp 239）形成额外的相互作用，可能影响结合亲和力和特异性。

异恶唑基青霉素结合破坏α/β结构域与Ω环间的氢键

比较apo（无配体）和配体结合结构发现，异恶唑基青霉素的结合导致Asn 170与Asp 240间关键氢键的断裂（距离从3.1-3.2?增加至3.4-3.6?）。这一变化此前仅在CTX-M酶与大体积头孢菌素结合时被观察到，表明异恶唑基青霉素也能诱导活性中心扩张以适应其疏水基团。

氯代增加异恶唑基青霉素与CTX-M-14结合的灵活性

研究发现，苯环氯代程度与构象异质性呈正相关：无氯的Oxacillin仅显示单一构象；单氯的Cloxacillin出现两个构象；双氯的Dicloxacillin则呈现至少三个构象。这种"构象梯度"现象表明，氯原子引入不仅增加疏水性，还通过立体效应增强了配体的动态行为。

该研究通过室温晶体学技术，首次揭示了异恶唑基青霉素与A类β-内酰胺酶的精确结合模式，并发现苯环氯代可显著增加配体构象异质性。更重要的是，研究证实异恶唑基青霉素能够破坏CTX-M-14中连接Ω环与α/β结构域的关键氢键，这一现象此前仅见于大体积头孢菌素的结合过程。这些发现不仅填补了长达半个世纪的结构生物学空白，更为理解抗生素与耐药酶间的分子识别机制提供了新视角。室温晶体学捕获的构象异质性信息，为针对ESBLs的理性药物设计提供了宝贵结构基础，有望推动新一代β-内酰胺酶抑制剂的开发。