一种超长效、不易聚集的双胺酰肽和降钙素受体激动剂的工程设计：在肥胖和糖尿病治疗中具有持久疗效

《Journal of Medicinal Chemistry》：Engineering of an Ultralong-Acting and Nonaggregating Dual Amylin and Calcitonin Receptor Agonist with Durable Efficacy in Obesity and Diabetes

本研究提出一种“亲电体优先”策略，利用含氟磺酸盐片段库通过热转移试验筛选共价抑制剂，成功发现靶向hMcl-1蛋白His224位点的化合物，并验证其特异性及活性。热转移试验显示化合物诱导热稳定性显著改变，结合质谱和核磁共振分析证实共价结合，晶体结构显示化合物与组氨酸形成稳定的磺酰胺键，且引入氯原子增强亲脂性的衍生物IC50达2.5 μM，为新型抗凋亡药物开发提供新方向。

　　
该研究首次报道了一种基于亲电体的"电亲体优先"策略，用于从数百种芳基氟磺酸盐片段库中筛选出靶向hMcl-1蛋白His224的新化合物。该策略通过结合热变性温度测定、核磁共振（NMR）和质谱（MS）分析，实现了高效且经济的药物发现流程。

在方法学层面，研究团队构建了包含320种芳基氟磺酸盐的片段库。这些化合物具有以下特性：1）稳定的氟磺酸基团在生物体内水溶性好且不易分解；2）芳环结构可提供多样化的疏水相互作用位点；3）分子量分布在200-500 Da之间，符合片段化合物的特征。通过优化筛选条件（配体/蛋白比例>10:1，孵育时间延长至48小时），有效提高了非共价结合片段的共价结合识别率。

热力学分析显示，当化合物与hMcl-1蛋白共价结合时，ΔTm（热变性温度变化）可达+10°C以上，显著高于可逆结合片段（ΔTm<1°C）。这一发现验证了热变性温度作为共价结合的生物标记物的可靠性。特别值得注意的是，筛选出的阳性化合物2在质谱分析中与野生型蛋白形成1:1共价加合物，而突变型（His224Ala）则完全失去结合能力，这为确定靶标残基提供了有力证据。

结构生物学研究揭示了化合物2与hMcl-1的结合模式：其氟磺酸基团通过亲核反应与His224的咪唑环共价结合，形成稳定的硫酰胺键。X射线晶体学数据显示，该化合物占据BH3结合口袋的疏水口袋，与Arg263形成π-π堆积，同时通过氟原子的强吸电子效应增强结合亲和力。值得注意的是，这种结合方式与之前报道的基于二硫键或硼酸酯的共价抑制剂存在显著差异，为hMcl-1靶向药物设计开辟了新途径。

结构活性关系（SAR）研究显示，引入氯原子（165D9）和优化芳环取代基可显著提升活性。在Delphi位移实验中，优化后的化合物165D9展现出2.5 μM的IC50值，较原始化合物活性提升约3倍。分子对接模拟进一步表明，氯原子通过C-Cl键与口袋中的Trp residue形成强疏水相互作用，同时氟磺酸基团与His224的咪唑环形成共价键。

该研究建立的筛选策略具有三个创新点：1）开发了基于热变性温度的快速初筛方法，灵敏度达±0.01°C；2）通过突变体筛选（His224Ala、Lys234Ala、His252Ala）结合质谱分析，实现了靶点残基的精准鉴定；3）采用NMR动态监测技术（15N标记His侧链），可在孵育1小时后检测到共价结合的化学位移扰动。

在应用层面，研究成功推导出首个靶向hMcl-1 His224的氟磺酸共价抑制剂，其结构特征包括：1）刚性芳环结构确保空间匹配；2）氟磺酸基团提供双重优势（强亲电性和稳定水溶性）；3）通过疏水取代基优化（如Cl、Br原子引入）可调节蛋白结合动力学。这种策略为克服hMcl-1作为传统抑制剂的耐药性提供了新思路，特别是针对肿瘤微环境中pH值降低的情况（pH6.5时仍保持稳定结合）。

未来优化方向包括：1）引入刚性杂环增强芳环堆积效应；2）开发多氟磺酸基团化合物以增强电子效应；3）结合计算模型优化疏水-亲水平衡。该研究验证了芳基氟磺酸盐在His/Lys/Tyr靶向中的潜力，为设计新型口服共价抑制剂提供了技术框架，特别是在蛋白-蛋白相互作用（PPI）领域，传统可逆抑制剂难以达到的亲和力阈值（IC50<10 μM）可通过此策略实现突破。

该成果对药物开发具有三重启示：首先，建立了适用于非半胱氨酸残基的"电亲体优先"策略；其次，开发了基于热力学稳定性的高通量筛选平台；最后，揭示了hMcl-1 BH3结合口袋中新的疏水口袋，为后续药物设计提供结构基础。特别是化合物165D9在体外实验中展现出24小时稳定抑制hMcl-1的功能，为开发长效制剂奠定了基础。