单细胞解析揭示近视多器官共享的促炎巨噬细胞特征及低氧通路机制

《Cell Discovery》：Single-cell profiling reveals a shared proinflammatory macrophage signature across multiple organs in myopia

本刊推荐：为阐明近视的系统性病理机制，研究人员通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)构建近视小鼠多器官转录组图谱，发现巨噬细胞在多个组织中显著增加并呈现促炎表型，其特征为低氧通路(HIF-1α/Car1/ROS)激活。抑制低氧通路可逆转巨噬细胞表型并减缓近视进展。临床队列分析揭示16种近视相关眼外疾病，提示促炎巨噬细胞可能为跨器官共享机制，为近视系统性防治提供新靶点。

　　

在全球范围内，近视已成为导致视力损害的主要原因，其患病率迅速上升。传统上，近视被视为一种局部的眼部疾病，主要关注眼球本身的屈光异常。然而，近年来的研究发现，近视眼中存在炎症性微环境，泪液和房水中促炎细胞因子水平升高，视网膜和巩膜中炎症浸润增加。更引人注目的是，越来越多的证据表明，近视可能与眼外器官存在关联。例如，研究发现近视与焦虑之间存在联系，暗示了眼-脑通讯的作用；近视患者的肠道微生物群失调也提示了眼-肠轴的可能参与。这些发现表明，近视可能涉及超越眼部组织的病理过程，其系统性影响可能与炎症机制相关。然而，近视与其他器官疾病之间的联系研究甚少，更不用说共享的潜在机制。

为了深入探索近视的系统性病理机制，研究人员在《Cell Discovery》上发表了最新研究成果。他们假设近视可能涉及多器官的交叉对话，并利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，构建了近视小鼠的多器官转录组图谱，旨在揭示近视过程中的免疫学改变及其跨器官共享机制。

研究人员首先成功建立了近视小鼠模型，通过在小鼠双眼前附加-25D透镜4周，诱导产生显著的近视屈光状态和眼轴延长。随后，他们从15种组织中分离细胞，包括眼部(脉络膜/视网膜)、脑部(初级视觉皮层/外侧膝状体/海马)、免疫组织(外周血单核细胞/骨髓/脾脏/胸腺)以及其他器官(小肠/大肠/肝脏/肾脏/肺/肾上腺)，并进行了scRNA-seq分析。经过质量控制后，共保留了200,127个合格细胞进行深入分析。

研究发现，近视诱导了小鼠全身性的免疫学改变。通过计算各组织中"炎症反应"标志基因集的富集分数，发现多个器官的炎症反应评分一致上调，特别是在视网膜、大肠、肝脏和肾脏中。这表明免疫细胞可能在近视中发挥关键作用。进一步分析显示，近视组与对照组相比，在多个组织中显示出不同的细胞分布，尤其是免疫细胞分布。具体而言，在近视小鼠的多个组织(如外周血单核细胞、骨髓、脾脏、小肠、大肠和肝脏)中，巨噬细胞的数量呈现增加趋势。

为了深入探索近视小鼠不同组织间共享的免疫学改变，研究人员对免疫细胞(CD45+)进行了整合聚类分析。免疫细胞被分为七种主要类型：巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DCs)、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞；巨噬细胞进一步细分为单核细胞来源的巨噬细胞和常驻巨噬细胞。值得注意的是，巨噬细胞和常驻小胶质细胞显示出与光刺激检测和视觉感知相关基因的富集。在免疫细胞中，巨噬细胞的百分比在近视小鼠的多个组织(包括脉络膜、外周血单核细胞、骨髓、小肠、大肠和肝脏)中显著升高，这突出了近视诱导的跨多个组织免疫细胞组成中巨噬细胞丰度的一致性增加。

研究人员进一步研究了巨噬细胞的基因表达模式。免疫细胞差异表达基因(DEGs)分析显示，共有27,452个上调和33,137个下调的DEGs，其中分别有40.6%和37.5%来自巨噬细胞。在免疫细胞中，巨噬细胞表现出最高数量的DEGs，包括视网膜和脑中的小胶质细胞、常驻巨噬细胞以及单核细胞来源的巨噬细胞。此外，小胶质细胞在近视小鼠的初级视觉皮层和海马中显示出特别高的DEGs频率，而巨噬细胞在外周血单核细胞、大肠和肾脏中显示出显著高的DEGs频率。在这些免疫相关DEGs中，上调最显著的基因是Car1，该基因编码一种与巨噬细胞活性低氧相关调节相关的锌金属酶碳酸酐酶，在小肠、肝脏和肾脏中共享。此外，细胞通讯模式也显示，与对照组相比，近视组中巨噬细胞之间以及巨噬细胞与上皮细胞之间的配体-受体相互作用活性显著更高。

为了阐明近视小鼠中巨噬细胞的具体表型，研究人员进一步将巨噬细胞分为17个亚群。与对照组相比，近视组显示促炎亚群(如Macro_Apoc1、Macro_S100a等)显著增加，而抗炎亚群(如Macro_Chil3、Macro_Glul等)减少。特别是在近视组炎症反应富集评分较高的组织中，观察到促炎巨噬细胞亚群的一致性增加和抗炎亚群的减少。视网膜巨噬细胞显示促炎亚群Macro_Sag增加和亚群Macro_Glul减少。近视组巨噬细胞在大肠中上调了促炎性Ifitm3/6、Apoc1和Bst2-Siglech，在肝脏中上调了促炎性ly6c1、Apoc1和S100a，在肾脏中上调了ly6c1和S100a。因此，除了近视小鼠巨噬细胞丰度增加和基因表达模式改变外，研究人员进一步阐明近视诱导的巨噬细胞在多个组织中主要呈现促炎表型。

为了揭示可能导致上述巨噬细胞促炎表型的分子通路，研究人员评估了近视小鼠巨噬细胞中的调控通路和基因。有趣的是，这些巨噬细胞在代谢相关通路中表现出比非代谢通路更高的变异。在以炎症表型为主的组织中，如肠道、肝脏、肾脏和视网膜，糖酵解、碳和丙酮酸代谢等通路上调，而氧化磷酸化下调，提示低氧相关能量代谢与巨噬细胞促炎表型之间存在联系。此外，调控转录因子，如小肠中的Cdx2和肝脏中的Atf4(两者均参与低氧通路)在近视中被激活。在关键调控基因方面，低氧相关的Car1(如前所述在免疫细胞中上调)也是近视小鼠巨噬细胞中上调最显著的基因。它主要在小肠、肝脏和肾脏中表达。值得注意的是，Car1主要在促炎巨噬细胞亚群(包括Macro_Apoc1和Macro_S100a)中上调。这些结果表明低氧通路可能在近视的巨噬细胞中被广泛激活。

此外，研究人员在蛋白质水平上验证了近视中促炎巨噬细胞以及这些巨噬细胞中低氧通路相关基因的表达。通过免疫荧光和流式细胞术分析，他们观察到近视小鼠肠道、肝脏和肾脏中CD68+巨噬细胞的比例显著增加，并且这些巨噬细胞中Car1的表达上调，特别是在4周时。随着近视的进展，促炎巨噬细胞及其低氧反应基因Car1的表达也逐渐增加。此外，他们还发现肠道、脾脏、肝脏和肾脏巨噬细胞中低氧诱导因子HIF-1α的表达上调，以及其上游因子ROS(可增加和稳定HIF-1α)的水平增加，特别是在近视小鼠的大肠和肝脏巨噬细胞中。这些发现表明，激活的低氧通路可能是跨组织巨噬细胞促炎表型的共享特征。

重要的是，通过系统性使用红景天苷(salidroside)抑制近视小鼠的低氧通路，研究人员发现，与注射生理盐水的组相比，近视小鼠大肠、肝脏和肾脏中CD68+巨噬细胞的比例以及这些巨噬细胞中Car1和HIF-1α的上调表达显著降低。此外，红景天苷治疗组的屈光近视程度低于生理盐水组。结果表明，通过系统性抑制低氧通路，在多个近视组织中观察到的巨噬细胞促炎表型受到抑制，这再次证实了激活的低氧通路在近视系统性促炎巨噬细胞改变中的作用。

为了进一步在人类中确认促炎巨噬细胞的共享特征，研究人员通过流式细胞术发现，与无近视者相比，近视患者血液中促炎巨噬细胞(CD68+)的比例增加，以及低氧相关Car1、Hif-1α和ROS的表达上调。为了进一步验证低氧通路在人类促炎巨噬细胞中的作用，他们进行了体外实验。在低氧条件下培养48小时的人类巨噬细胞显示出与低氧(Hif-1α)、炎症(Tnf-α、iNos)和糖酵解(Glut1、Hk2、Pkm2)相关基因的表达水平显著升高。这些结果表明低氧可以增强糖酵解过程并驱动人类巨噬细胞的促炎极化，这与上述动物实验的结果一致。

尽管在近视小鼠和人类的多个器官中发现了促炎巨噬细胞共享的低氧相关特征，但其临床相关性仍不清楚。为了验证近视与其他器官疾病之间的临床联系，基于英国生物银行(UK Biobank)114,661名参与者的数据，研究人员比较了对照组和近视组之间989种疾病表型的发病率。总共确定了16种近视偏向患病率的眼外疾病(10种调整后P<0.05；6种未调整P<0.05且调整后P值接近0.05)，被定义为近视相关疾病，包括早发性阿尔茨海默病、骨髓纤维化、肝纤维化等。此外，研究人员还在一个亚洲患者队列中发现近视与肾脏疾病和过敏性鼻炎的患病率密切相关。有证据表明，促炎巨噬细胞在大多数上述近视相关疾病中起关键作用。

本研究主要应用了几项关键技术方法：首先，通过在小鼠双眼附加-25D透镜成功建立了离焦诱导的近视小鼠模型，并利用自动偏心红外折射计和眼部磁共振成像(MRI)验证了模型的成功。其次，研究人员从15种小鼠组织中分离细胞，采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术（基于10x Genomics Chromium平台）构建了全面的多器官转录组图谱，并对数据进行了严格的质控、整合聚类和细胞类型注释分析。第三，利用免疫荧光染色和流式细胞术在蛋白质水平上验证了关键发现，包括巨噬细胞标志物CD68、低氧相关蛋白Car1和HIF-1α的表达。第四，通过体外实验，将人类巨噬细胞（THP-1来源）置于低氧条件(1% O₂)下培养，评估低氧对巨噬细胞极化和代谢的影响。最后，基于英国生物银行(UK Biobank)114,661名参与者的大规模临床队列数据，进行了疾病表型与近视关联的流行病学分析。样本队列来源包括实验动物（C57BL/6J小鼠）、人类外周血单核细胞(PBMCs)以及大型生物样本库（UK Biobank和KNHANES数据库）的临床数据。

Myopia induction generates pan-tissue immunologic alterations in mice

研究人员成功建立了近视小鼠模型，证实4周透镜诱导可导致显著屈光近视和眼轴延长。scRNA-seq分析涵盖15种组织，鉴定出44种细胞类型。炎症反应基因集富集评分显示多个器官评分上调，特别是在视网膜、大肠、肝脏和肾脏，表明免疫细胞在近视中起关键作用。细胞分布分析揭示近视组免疫细胞分布改变，巨噬细胞在多个组织（如PBMC、骨髓、脾脏、肠道和肝脏）中呈现增加趋势，表明近视诱导了广泛的全身性免疫学改变。

Immunologic alterations exhibit consistently increased abundance and altered gene expression patterns of macrophages across most tissues in myopic mice

免疫细胞整合聚类分析显示巨噬细胞比例在近视小鼠多个组织（脉络膜、PBMC、骨髓、小肠、大肠和肝脏）中显著升高。DEGs分析表明巨噬细胞（包括小胶质细胞和单核来源巨噬细胞）具有最高数量的差异表达基因，其中Car1是上调最显著的基因，在肠道、肝脏和肾脏共享。细胞通讯分析显示近视组巨噬细胞间及其与上皮细胞的相互作用活性增强。这些发现揭示了近视小鼠巨噬细胞在丰度和基因表达模式上均发生显著改变。

Proinflammatory macrophage phenotype is shared across multiple tissues in myopic mice

巨噬细胞亚群分析发现近视组促炎亚群（如Macro_Apoc1, Macro_S100a）增加，抗炎亚群（如Macro_Chil3, Macro_Glul）减少。在炎症评分高的组织中，此趋势尤为明显。例如，视网膜巨噬细胞促炎亚群Macro_Sag增加，肠道、肝脏和肾脏巨噬细胞分别上调特定促炎基因。这表明近视诱导的巨噬细胞在多个组织中呈现一致的促炎表型。

The proinflammatory macrophages in myopic mice are characterized by activation of hypoxia pathway

通路分析显示近视小鼠巨噬细胞的代谢通路（如糖酵解）变异度高，在炎症组织中糖酵解通路上调而氧化磷酸化下调。关键低氧相关基因Car1在巨噬细胞中上调最显著，尤其在促炎亚群中富集。蛋白水平验证证实CD68+巨噬细胞比例增加，且其Car1、HIF-1α和ROS表达上调，表明低氧通路激活是跨组织促炎巨噬细胞的共享特征。

Inhibition of hypoxia pathway can suppress the proinflammatory phenotype of macrophages across multiple tissues of myopic mice

使用红景天苷抑制低氧通路后，近视小鼠肠道、肝脏和肾脏中CD68+巨噬细胞比例及其Car1和HIF-1α表达显著降低，同时屈光近视程度减轻。这表明抑制低氧通路可逆转巨噬细胞的促炎表型并减缓近视进展，证实了低氧通路在近视系统性改变中的关键作用。

Confirmation of the shared proinflammatory macrophage signature and its association with extraocular diseases in myopic patients

在人类中验证发现近视患者血液中促炎巨噬细胞（CD68+）比例及低氧相关分子（Car1、HIF-1α、ROS）表达增加。体外实验证实低氧可驱动人类巨噬细胞向促炎表型极化并增强糖酵解。临床队列分析揭示16种眼外疾病与近视患病率相关（如早发性阿尔茨海默病、骨髓纤维化等），且这些疾病多数已知与促炎巨噬细胞病理相关，提示了近视与全身性疾病通过巨噬细胞联系的临床证据。

本研究通过整合单细胞转录组学、动物模型、体外实验和临床队列分析，首次系统揭示了近视中存在多器官交叉对话，其共享机制是低氧通路驱动的促炎巨噬细胞表型。这一发现突破了传统上将近视视为局部眼病的局限，将其置于全身性炎症疾病的框架下理解。研究不仅揭示了Car1/HIF-1α/ROS低氧通路在调控巨噬细胞能量代谢（糖酵解与氧化磷酸化平衡）和促炎极化中的核心作用，还通过干预实验证明靶向低氧通路（如使用红景天苷）可有效逆转巨噬细胞表型和近视进展，为近视的系统性治疗提供了新策略。

更重要的是，研究通过大规模临床数据分析将近视与16种眼外疾病联系起来，建立了近视与全身健康状态的临床关联，提示监测血液中特定巨噬细胞亚群及其低氧相关基因表达可能成为评估近视进展和系统性炎症风险的无创生物标志物。这项研究的意义在于将近视的病理机制从眼球局部扩展到全身系统，揭示了免疫代谢调节在近视发生发展中的重要作用，为开发针对近视及其相关全身并发症的新型干预措施奠定了坚实的理论基础，有望引领近视防治进入一个更全面、更精准的新时代。