蛋白酶激活受体2的结构基础与偏向性激动机制解析

《Cell Discovery》：Structural basis of protease-activated receptor 2 activation and biased agonism

本研究通过冷冻电镜技术解析了蛋白酶激活受体2（PAR2）与Gq/G13蛋白复合物的高分辨率结构，揭示了其被栓系配体（TL）激活的分子机制及G蛋白偶联选择性规律。研究人员创新性地设计出选择性激活Gq信号通路的偏向性肽类配体，为开发靶向PAR2的炎症性疾病精准治疗药物提供了结构基础。

　　

在细胞信号传导的复杂网络中，蛋白酶激活受体（Protease-activated receptors, PARs）家族因其独特的激活机制而备受关注。作为G蛋白偶联受体（GPCRs）的重要成员，PAR2通过不可逆的蛋白酶水解其N末端，释放出栓系配体（Tethered Ligand, TL）来激活下游信号通路。这种受体在炎症反应、疼痛感知、细胞通透性等生理和病理过程中扮演关键角色，成为治疗关节炎、哮喘和神经性疼痛等疾病的潜力靶点。然而，尽管PAR2的重要性日益凸显，科学家们对其激活机制的理解仍存在重大空白——活跃状态下的PAR2三维结构如何？栓系配体如何与受体结合并引发激活？不同G蛋白信号通路的选择性是如何实现的？这些问题的答案对于开发精准靶向PAR2的药物至关重要。

为了解开这些谜团，哈尔滨工业大学生命科学中心的研究团队在《Cell Discovery》上发表了突破性研究成果。他们采用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了PAR2与miniG_s/q和miniG₁₃复合物的高分辨率结构，分辨率分别达到3.25?和3.2?。这是首次在原子水平揭示PAR2的活跃构象，为理解该受体的激活机制提供了直观的结构蓝图。

研究团队采用多项关键技术方法：通过NanoBiT拴系策略增强复合物稳定性，利用冷冻电镜单颗粒分析技术解析结构，采用分子动力学（MD）模拟研究动态相互作用，建立BRET2、BRET0和NanoBiT等多种生物发光共振能量转移检测体系评估信号活性，并通过点突变和肽类配体合成验证结构发现。

TL-受体相互作用

研究显示，TL以平行β-折叠构象与PAR2的胞外第二环（ECL2）结合，形成稳定的相互作用网络。

具体而言，S37_TL1和L38_TL2的骨架酰胺基团分别与D228_ECL2和L230_ECL2的骨架羰基形成氢键。K41_TL5的骨架与S60_N-term形成氢键，其侧链与E232_ECL2形成盐桥。功能实验证实，破坏这些关键相互作用会显著降低受体活性。

受体激活

与拮抗剂AZ8838结合的PAR2结构相比，TL结合引发跨膜区构象重排，特别是TM6在胞外侧发生外移。

这一变化导致抑制性离子锁（ion lock）崩溃，Y344_7.53（NPxxY基序）和R173_3.50（DRY基序）向细胞内腔中心移动，为G蛋白结合创造空间。整个激活过程始于TL结合引发的TM6构象变化，最终导致细胞内腔完全开放。

G_q和G₁₃结合与选择性

结构比较发现，PAR2与不同G蛋白的相互作用模式存在显著差异。

G_q结合主要依赖极性相互作用，而G₁₃结合则由疏水相互作用主导。特别值得注意的是，Ga₁₃的最后一个甲硫氨酸残基（M228_G.H5.24）插入由TM7-H8-TM1-TM2形成的疏水口袋（称为"甲硫氨酸口袋"）中，这一独特相互作用是G₁₃选择性的关键决定因素。突变实验证实，降低该口袋的疏水性会显著抑制G₁₃活性而不影响G_q信号。

偏向性激动与G_q偏向性肽配体设计

最令人兴奋的发现来自于对TL第三位残基（I39_TL3）与TM1 N末端D62相互作用的研究。

分子动力学模拟显示，I39_TL3与D62_N-term之间形成稳定的氢键相互作用。破坏这一相互作用（通过D62A突变或I39V突变）能选择性抑制G₁₃信号而保留G_q活性。基于这一发现，研究团队成功设计出SLVGRL-NH₂肽，该肽能特异性激活G_q通路而几乎不触发G₁₃信号，成为首个理性设计的PAR2 G_q偏向性激动剂。

这项研究不仅首次揭示了PAR2的活跃状态结构，还阐明了其激活机制和G蛋白选择性的结构基础。更重要的是，研究团队基于结构发现成功设计出具有偏向性信号特性的肽类配体，为开发靶向PAR2的精准疗法提供了新策略。该研究成果深化了对PAR家族受体信号转导机制的理解，为治疗炎症性疾病、疼痛综合征等相关疾病提供了重要的理论依据和药物设计蓝图。这种结构指导的偏向性配体设计策略也有望应用于其他GPCR靶点的药物开发中，推动精准医疗的发展。