AGR2通过p53/FPN1调控轴抑制铁死亡并驱动胰腺癌治疗新策略

《Cell Death & Disease》：AGR2 suppresses ferroptosis via the p53/FPN1 regulatory axis and drives therapeutic vulnerabilities in pancreatic cancer

本研究聚焦胰腺导管腺癌(PDAC)治疗抵抗难题，发现前梯度蛋白2(AGR2)通过p53/铁转运蛋白(FPN1)轴调控铁死亡的新机制。研究人员通过体内外实验证实AGR2缺失可激活p53信号，下调铁 exporter FPN1表达，导致细胞内铁超载而增强铁死亡敏感性。临床数据分析显示AGR2与FPN1表达正相关，且双高表达患者预后更差。研究进一步开发靶向AGR2的多肽，可协同铁死亡诱导剂显著抑制肿瘤生长。该研究不仅揭示了AGR2/p53/FPN1通路在铁死亡调控中的关键作用，更为PDAC的联合治疗提供了新思路。

　　

胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度最高的肿瘤之一，五年生存率不足10%，其治疗抵抗性强、预后极差，亟待探索新的治疗靶点。铁死亡(Ferroptosis)作为一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，在诱导耐药肿瘤细胞死亡方面展现出巨大潜力。然而，胰腺癌如何调控铁死亡敏感性，以及致癌因子如何参与这一过程，仍是未解之谜。

前梯度蛋白2(AGR2)作为一种蛋白二硫键异构酶，在胰腺癌中高表达，与肿瘤转移、化疗抵抗密切相关。有趣的是，研究人员发现，当用铁死亡诱导剂Erastin或RSL3处理胰腺癌细胞时，AGR2的表达显著上调，且这一现象可被铁死亡特异性抑制剂Liproxstatin-1(Lip-1)和Ferrostatin-1所逆转，而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK或坏死性凋亡抑制剂NSA则无此效果，提示AGR2的上调是铁死亡过程中的特异性事件。

为了探究AGR2在铁死亡中的功能，研究人员构建了AGR2基因敲除(KO)的PDAC细胞系。结果发现，在p53野生型(WT)的HPAC和Capan2细胞中，AGR2缺失显著增强了细胞对Erastin或RSL3诱导的铁死亡的敏感性，表现为细胞死亡率增加、脂质过氧化水平升高、谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值降低、丙二醛(MDA)和前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2) mRNA水平上升。而在p53突变型(MUT)的PANC1、MiaPaCa2和AsPC-1细胞中，AGR2敲除并未产生同样的增敏效应，提示AGR2调控铁死亡依赖于p53。

机制研究表明，AGR2作为p53的抑制因子，其缺失可激活p53信号通路。研究人员通过转录组学分析、染色质免疫共沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验证实，p53可直接结合到铁输出蛋白SLC40A1(编码FPN1)的启动子区域，并抑制其转录。AGR2缺失导致的p53激活，会下调FPN1的表达，引起细胞内铁离子蓄积，最终诱发铁死亡。

临床相关性分析显示，在TCGA数据库和本研究的PDAC患者样本中，AGR2与SLC40A1 mRNA表达呈正相关。免疫组化结果进一步证实，AGR2与FPN1蛋白在肿瘤组织中共表达，且双高表达与患者不良预后显著相关。

基于上述发现，研究人员开发了一种靶向AGR2的多肽。体外实验表明，该多肽处理可上调p53、下调FPN1，增强细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。在移植瘤模型中，AGR2靶向多肽与铁死亡诱导剂IKE联合使用，可显著抑制肿瘤生长，且该效应可被Lip-1逆转，证实其作用机制是通过促进铁死亡实现的。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除细胞系；通过RNA测序进行转录组学分析；采用蛋白质印迹(Western blot)检测蛋白表达；通过染色质免疫共沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验分析转录调控；使用患者来源的肿瘤组织样本进行免疫组化分析；建立异种移植瘤模型进行体内药效评价。

AGR2在铁死亡中的上调作用

研究人员发现，用铁死亡诱导剂Erastin或RSL3处理PDAC细胞系(HPAC和Capan2)后，AGR2在mRNA和蛋白水平均显著上调，且这一效应可被铁死亡特异性抑制剂逆转。这表明AGR2是铁死亡过程中的一个响应因子。

AGR2是胰腺癌中铁死亡的负调控因子

在p53野生型PDAC细胞中，AGR2敲除显著增强了细胞对铁死亡诱导剂的敏感性，增加了脂质过氧化等铁死亡标志物水平。而在p53突变型细胞中无此效应，说明AGR2通过p53依赖的方式抑制铁死亡。

AGR2 KO通过铁死亡抑制原位PDAC肿瘤发展

在移植瘤模型中，AGR2敲除或IKE(铁死亡诱导剂)单独处理均可抑制肿瘤生长，而两者联合具有协同效应。铁死亡抑制剂Lip-1可逆转这一效应，证实AGR2敲除是通过促进铁死亡来抑制肿瘤生长的。

AGR2作为p53抑制因子调控铁死亡

p53敲低可挽救AGR2敲除导致的铁死亡增敏效应，证明AGR2通过抑制p53活性来调控铁死亡敏感性。

AGR2通过调控p53抑制铁转运蛋白表达

AGR2敲除可抑制FPN1表达，而p53敲低或p53激活剂Nutlin-3a处理可逆转这一效应。ChIP和荧光素酶报告基因实验证实p53可直接结合SLC40A1启动子并抑制其转录。

铁转运蛋白抑制胰腺癌中的铁死亡

FPN1敲低或铁转运蛋白抑制剂hepcidin处理均可诱导铁死亡标志物表达升高，促进脂质过氧化和细胞内铁积累，证实FPN1在抑制铁死亡中发挥重要作用。

AGR2与SLC40A1表达在胰腺癌中正相关

临床样本分析显示，AGR2与SLC40A1(FPN1)表达呈正相关，且双高表达患者预后较差，支持AGR2-FPN1轴在PDAC中的临床相关性。

AGR2阻断多肽增敏PDAC细胞铁死亡

靶向AGR2的多肽可增强细胞对铁死亡诱导剂的敏感性，在体外和体内均验证了靶向AGR2-p53-FPN1轴的治疗潜力。

本研究系统阐明了AGR2-p53-FPN1调控轴在PDAC铁死亡中的关键作用。AGR2通过抑制p53活性，下调铁输出蛋白FPN1表达，导致细胞内铁离子蓄积，从而增强铁死亡敏感性。临床数据进一步证实了AGR2与FPN1的相关性及其预后价值。研究还开发了靶向AGR2的治疗多肽，为PDAC的联合治疗提供了新策略。这项研究不仅揭示了AGR2在铁死亡调控中的新功能，也为克服胰腺癌治疗抵抗提供了潜在靶点。论文发表于《Cell Death and Disease》期刊，为胰腺癌的精准治疗提供了重要的理论依据和实验证据。