Ca2+-NFATc1-Fis1信号轴通过调控线粒体动力学介导辐射性骨损伤中间充质干细胞成骨障碍

《Cell Death & Disease》：Mitochondrial dysfunction in mesenchymal stem cells impairs osteogenesis in radiation-induced bone injury via Ca2+-NFATc1-Fis1 pathway

本研究揭示了放疗所致骨损伤的新机制。为解决辐射导致骨髓间质干细胞（MSC）成骨分化障碍的难题，研究人员发现辐射通过激活Ca2+-CaN-NFATc1信号通路上调Fis1表达，诱发线粒体过度分裂，导致氧化磷酸化（OXPHOS）抑制和ATP合成减少，最终损害MSC成骨能力。靶向抑制Fis1可显著改善线粒体功能并促进骨修复，为辐射性骨损伤提供了新的治疗策略。

　　

头颈部癌症患者在接受放射治疗后，常常面临一个棘手的并发症——放射性骨坏死（osteoradionecosis）。这种病症表现为骨组织血供障碍、坏死和修复困难，严重影响患者的生活质量。当前的治疗手段，如手术、抗生素或高压氧治疗，效果往往不尽如人意。究其根本，辐射在杀死癌细胞的同时，也对正常的骨组织微环境造成了严重破坏。其中，作为骨形成关键细胞的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）的功能受损被认为是导致骨修复障碍的核心环节。虽然辐射的破坏作用通常归因于DNA损伤和氧化应激，但作为细胞能量工厂的线粒体在其中扮演的角色日益受到关注。在MSCs向成骨细胞分化的过程中，线粒体的活化和能量代谢的转换至关重要。然而，辐射是如何扰乱MSCs的线粒体功能，进而阻碍成骨分化的，其内在的分子机制尚不清晰。发表在《Cell Death & Disease》上的这项研究，正是为了解开这个谜团。

为了深入探究这一问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究构建了小鼠胫骨辐射损伤模型（8 Gy单次照射），并通过小动物活体成像技术验证了体内干预的有效性。在细胞层面，分离培养了小鼠骨髓来源的MSCs，并建立了体外辐射（8 Gy）模型。研究采用了micro-CT（微型电子计算机断层扫描）进行骨微结构分析，通过Seahorse细胞能量代谢分析仪检测线粒体氧化磷酸化功能（OCR，氧消耗速率），利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和MitoTracker染色结合ImageJ-MiNA软件分析线粒体形态动力学。在分子机制探索上，运用了RNA测序（RNA sequencing）、染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）验证转录因子结合、蛋白质印迹（Western blotting）分析蛋白表达与核质转位，以及小干扰RNA（siRNA）和过表达载体进行基因功能获得（gain-of-function）和功能缺失（loss-of-function）研究。

3.1. 辐射破坏骨稳态并抑制MSC成骨分化

研究人员首先在动物模型中证实了辐射对骨骼的破坏性影响。照射后28天，micro-CT分析显示， irradiated (IR) 小鼠的胫骨出现了显著的骨量丢失，表现为骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb. N）和骨矿物密度（BMD）的显著降低。组织学分析进一步揭示了骨小梁变薄、结构稀疏。免疫组化结果显示，成骨细胞标志物骨钙素（OCN）的表达在照射后早期即显著下降并持续至第28天，而破骨细胞标志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的细胞数在早期增加，但在第28天恢复至对照组水平。这表明辐射主要通过持续损害成骨性骨形成，而非短暂的破骨细胞活性增强，导致骨丢失。从IR小鼠骨髓中分离出的MSCs，其成骨分化能力明显受损，表现为碱性磷酸酶（ALP）活性降低、钙结节形成（Alizarin Red S染色）减少以及成骨相关基因（Alp, Runx2, Ocn）表达下调。

3.2. 辐射诱导MSCs线粒体功能障碍

为了探究MSC成骨能力受损的机制，研究人员将目光投向了线粒体。结果显示，与对照组相比，IR来源的MSCs活性氧（ROS）水平显著升高，而超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，表明氧化应激加剧。线粒体膜电位（MMP）显著降低，提示线粒体功能受损。通过Seahorse能量代谢分析发现，IR-MSCs的基础呼吸、最大呼吸能力和ATP生成相关的氧消耗率（OCR）均显著降低。ATP含量测定也证实了IR-MSCs的ATP合成减少。这些结果共同表明，辐射导致了MSCs的线粒体功能障碍。

3.3. 辐射促进线粒体分裂并上调Fis1表达

线粒体是高度动态的细胞器，其形态通过持续的分裂（fission）和融合（fusion）过程维持平衡，即线粒体动力学。MitoTracker染色和ImageJ-MiNA分析显示，IR-MSCs中线粒体网络碎片化程度显著增加，表现为“个体”（Individuals）线粒体比例升高，而网络平均尺寸减小。透射电镜观察发现，IR-MSCs的线粒体变得更趋于球形，嵴结构模糊，而对照组MSCs的线粒体则呈典型的管状结构。定量分析显示线粒体的球形度（globularity）显著增加。在分子水平上，线粒体分裂相关基因Drp1和Fis1的mRNA表达均上调，但在蛋白水平上，只有Fis1的表达显著增加，而Drp1的磷酸化（p-Drp1(Ser616)）水平虽有升高趋势但无统计学差异。体外用8 Gy照射MSCs得到了类似的结果，证实辐射确实诱发了以Fis1上调为特征的过度线粒体分裂。

3.4. Fis1抑制缓解辐射诱导的线粒体功能障碍和MSC成骨受损

接下来，研究人员通过siRNA敲低Fis1表达，探讨了Fis1介导的线粒体分裂在辐射损伤中的作用。结果表明，抑制Fis1能够有效逆转辐射引起的线粒体过度分裂，使线粒体网络形态得到改善。更重要的是，Fis1抑制显著降低了IR-MSCs的ROS水平，部分恢复了SOD活性，并提高了ATP的合成。Seahorse分析显示，其线粒体OCR各项参数也得到恢复。在功能上，Fis1抑制显著增强了IR-MSCs的成骨分化能力，ALP活性、钙结节沉积以及成骨基因（Alp, Runx2, Ocn）的表达均得到明显改善。这表明，靶向抑制Fis1可通过改善线粒体功能来挽救辐射导致的MSC成骨障碍。

3.5. 辐射通过Ca²⁺-CaN-NFATc1通路上调Fis1表达

机制探索部分，RNA测序及KEGG通路富集分析提示，钙信号通路和NFATc1在辐射后的MSCs中可能被激活。后续实验证实，IR-MSCs的胞内钙离子（Ca²⁺）浓度显著升高。钙离子内流激活了钙调磷酸酶（calcineurin, CaN），表现为CaN的mRNA表达和酶活性均增加。活化的CaN使其下游底物NFATc1去磷酸化，并促进其从细胞质向细胞核转位。利用siRNA抑制Nfatc1表达后，辐射引起的Fis1上调被显著抑制。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验进一步证实，NFATc1可以直接结合到Fis1基因启动子区的特定序列（-1868 bp ~ -1877 bp, GAAAGGAAAA）上，从而激活Fis1的转录。而过表达NFATc1则能上调Fis1并促进线粒体分裂。这些结果清晰地表明，辐射通过激活Ca²⁺-CaN-NFATc1信号轴，转录上调了Fis1的表达。

3.6. Fis1抑制部分挽救辐射诱导的骨损伤

最后，研究在动物模型中验证了靶向Fis1的治疗潜力。通过胫骨骨髓腔内注射Fis1特异性siRNA，成功降低了照射部位Fis1的表达。Micro-CT和组织学分析显示，与仅接受照射的IR组小鼠相比，接受Fis1 siRNA治疗的IR-siFis1组小鼠的骨量（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨密度（BMD）均有显著改善，骨 marrow中成骨标志物OCN表达升高，而成脂标志物PPAR-γ表达降低。从IR-siFis1小鼠骨髓中分离出的MSCs，其体外成骨分化能力也显著优于IR组来源的MSCs。这表明，在体抑制Fis1能够有效缓解辐射引起的骨丢失和MSC成骨功能障碍。

本研究系统性地揭示了一条全新的信号通路在辐射性骨损伤中的作用：辐射导致MSCs内Ca²⁺内流增加，激活CaN，进而使转录因子NFATc1去磷酸化并核转位，在细胞核内结合至Fis1基因的启动子区，上调Fis1的表达。Fis1的上调引发了线粒体的过度分裂，导致线粒体碎片化，其功能随之受损，表现为氧化磷酸化（OXPHOS）抑制、ATP生成不足以及抗氧化防御能力下降。这些线粒体功能的紊乱最终损害了MSCs的成骨分化能力，导致骨形成受阻。研究的重大意义在于，不仅阐明了Ca²⁺-CaN-NFATc1-Fis1这一此前未知的信号轴是连接辐射应激与MSC线粒体功能障碍的关键环节，更重要的是证明了靶向抑制Fis1能够有效逆转辐射的负面效应，改善线粒体功能并促进骨修复。这为开发针对放射性骨坏死等放疗并发症的新型治疗策略提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。