NEU1介导的α-2,6唾液酸化修饰在精子成熟与运动中的关键作用及男性不育新机制

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Epididymal epithelial cells facilitate NEU1 loading to modulate sperm α-2,6 sialylation, enhance maturation and motility

本研究针对男性不育中精子活力下降的临床难题，揭示了附睾上皮细胞通过外泌体转运NEU1至精子表面，调控α-2,6唾液酸化修饰，进而影响精子能量代谢、获能过程和受精能力。研究人员通过临床样本分析、小鼠模型构建及多组学技术，证实NEU1表达水平与精子运动参数正相关，其机制涉及EGFR膜转位和ERK/ATP信号通路激活。该研究为男性不育诊断提供了新型生物标志物（NEU1），并为靶向唾液酸化修饰的治疗策略开辟了新方向。

　　

在全球范围内，男性因素导致的不育约占不孕病例的50%，其中精子质量下降——特别是运动能力减弱和受精能力降低——是常见原因之一。尽管精液分析是临床评估男性生育力的主要手段，但现有方法在区分生育男性和不育男性方面存在显著重叠，凸显了当前诊断方法的局限性。精子成熟是一个复杂的多步骤过程，涉及多种分子机制，其中糖基化修饰，尤其是唾液酸化，在精子获能和受精中起着至关重要的作用。然而，唾液酸水解酶——神经氨酸酶-1（NEU1）在精子成熟和功能中的具体作用仍不清楚。

在这项发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》的研究中，研究人员通过整合计算预测和实验验证，评估了男性生殖道中唾液酸化相关酶的表达谱，确定了NEU1作为重点研究对象。他们发现NEU1在人和小鼠精子中高表达，且其表达水平与精子运动能力和受精能力密切相关。

研究人员运用了多种关键技术方法：通过免疫荧光、Western blot和流式细胞术分析NEU1表达模式；利用计算机辅助精液分析（CASA）评估精子运动参数；采用体外受精（IVF）实验验证NEU1功能；通过小鼠模型探索NEU1在精子成熟过程中的起源；使用 Seahorse 能量代谢分析系统检测精子代谢功能；并进行了蛋白质组学分析比较弱精症与正常精子样本的差异。

NEU1是精子中主要表达的唾液酸酶

研究发现NEU1和NEU3主要定位于睾丸间质和附睾上皮，而NEU2和NEU4在这些组织中未检测到。在人类精子中，NEU1的表达显著高于NEU3，表明NEU1是精子中的主要唾液酸酶。

精子NEU1表达与运动能力和生育结果相关

弱精症患者精子中的NEU1表达显著低于正常组，而不育男性的精子NEU1表达也明显降低。精子NEU1表达与运动参数（如直线速度VSL和前向运动百分比）呈正相关。ROC曲线分析显示，精子NEU1表达在预测弱精症和不育方面比精浆NEU1或精子NEU3具有更高的敏感性和特异性。

NEU1在小鼠精子中的表达模式与人类相似并在成熟过程中增加

免疫电镜显示NEU1主要定位于精子头部核区和尾部线粒体膜，在人和小鼠精子中空间分布高度保守。从睾丸到附睾，NEU1表达逐渐增加，表明其在精子成熟过程中受到动态调控。

获能后NEU1富集于精子膜，其抑制会损害运动能力和受精能力

获能处理后，精子表面NEU1表达显著增加，主要分布在尾部区域。通过上游法分选的高运动能力精子表现出更高的NEU1表达。NEU1抑制剂DANA处理显著降低了NEU1活性，导致人和小鼠精子运动能力明显下降。体外受精实验证实NEU1抑制显著降低了胚胎受精率。

NEU1从附睾上皮转运至精子以促进成熟

单细胞RNA测序分析显示，NEU1在精子成熟过程中表达逐渐增加，在附睾上皮细胞中表达升高。共聚焦显微镜证实NEU1主要定位于附睾上皮细胞的细胞质和质膜。小鼠附睾液具有高唾液酸酶活性和NEU1表达。共孵育实验证明附睾上皮细胞将NEU1转运至精子表面，而NEU1敲低则导致精子运动能力下降、唾液酸化水平升高和获能标志物减少。

附睾上皮分泌活性NEU1外泌体介导精子成熟

研究从附睾液中分离出外泌体，检测到NEU1表达。免疫电镜显示NEU1定位于小鼠附睾液外泌体膜上。原位免疫电镜捕捉到上皮细胞外泌体分泌过程。表面膜蛋白生物素化实验证实NEU1主要定位于外泌体膜。免疫共沉淀分析显示外泌体NEU1与β-半乳糖苷酶（β-Gal）和Caveolin1形成复合物。

抑制NEU1活性损害精子获能和能量代谢

NEU1抑制增加了PNA水平，抑制了获能后的酪氨酸磷酸化恢复。细胞外信号调节激酶（ERK）通路抑制剂降低了精子运动能力，而ERK激活剂缓解了DANA的抑制作用。同样，ATP通路抑制剂降低了精子运动能力，而激活剂挽救了DANA的抑制效应。Seahorse代谢分析显示NEU1抑制导致精子氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）显著降低，表明线粒体功能和糖酵解活性受损。流式细胞术进一步证实DANA处理降低了线粒体膜电位并升高了活性氧（ROS）水平。

弱精症与正常组的蛋白质组学分析

蛋白质组学分析鉴定了6008种蛋白质，其中504种在弱精症组和对照组之间存在显著差异表达。基因集富集分析（GSEA）显示，弱精症患者中细胞外基质组织和代谢疾病相关通路（如糖鞘脂代谢和鞘脂代谢）显著下调，而细胞衰老和凋亡通路显著上调。与人类精子膜蛋白质组中NEU1相互作用蛋白的交集分析确定了17个重叠基因，包括RAB27B、RAB3D、RAB27A和ITLN1，这些膜蛋白在弱精症中均与NEU1一起下调。

本研究系统阐明了NEU1在精子成熟和受精过程中的关键作用。NEU1作为精子表面的关键调节酶，直接影响精子运动能力和受精能力。附睾上皮细胞通过外泌体分泌NEU1并将其转运至精子表面，介导唾液酸化修饰，调节精子获能和代谢过程。这些发现不仅揭示了唾液酸酶在精子成熟和功能中的作用机制，还为男性不育的诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和靶点。

研究证实NEU1表达水平与精子运动参数正相关，其抑制会损害精子运动能力、能量代谢和受精能力。机制上，NEU1通过调节α-2,6唾液酸化，影响EGFR膜转位和ERK/ATP信号通路激活，进而调控精子获能过程。蛋白质组学分析进一步验证了NEU1及相关膜蛋白在弱精症中的下调，强调了唾液酸化修饰在男性生育力中的重要性。

该研究的创新点在于首次系统揭示了附睾上皮细胞通过外泌体途径将NEU1转运至精子表面的机制，并阐明了NEU1通过调控唾液酸化修饰影响精子功能的分子通路。这些发现不仅深化了对精子成熟机制的理解，也为开发针对男性不育的新型诊断方法和治疗策略提供了重要理论基础。未来的研究可进一步探索NEU1下游靶点的识别及其在精子功能调节中的具体作用机制，为男性生殖健康的精准医疗提供新思路。