GPR35介导单核细胞向李斯特菌感染部位募集的机制研究及其在宿主防御中的关键作用

《Cellular and Molecular Life Sciences》：GPR35 mediates monocyte recruitment to the sites of Listeria monocytogenes infection

本研究针对单核细胞在感染部位募集的分子机制尚未完全阐明的问题，开展了GPR35在单核细胞招募中的作用研究。通过构建Gpr35基因敲除小鼠模型，结合体内外实验证实GPR35通过激活整合素依赖性细胞粘附，促进Ly6Chi单核细胞向李斯特菌感染部位（肠道、肝脏和脾脏）迁移，并发现溶血磷脂酸（LPA）作为潜在配体在感染灶积累。研究首次揭示了GPR35信号通路通过增强TNF-α产生限制细菌负荷，为感染性疾病治疗提供了新靶点。

　　

当李斯特菌（Listeria monocytogenes）侵入人体时，免疫系统会迅速启动防御机制。其中，Ly6C^hi单核细胞作为炎症单核细胞亚群，在清除病原体中发挥着关键作用。这些细胞从骨髓进入循环系统，再迁移到感染部位，转化为产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮合酶（iNOS）的效应细胞，直接参与细菌清除。然而，单核细胞从血液向感染部位迁移的具体分子机制尚未完全阐明。虽然已知CCR2（CC趋化因子受体2）调控单核细胞从骨髓释放，但对其从循环系统向组织迁移的G蛋白偶联受体（GPCR）调控网络了解有限。

在这项发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》的研究中，日本静冈县立大学和大阪大学的研究团队揭示了GPR35在单核细胞招募中的关键作用。研究人员发现，GPR35这一GPCR家族成员，通过激活整合素依赖性粘附机制，指导单核细胞精准迁移至李斯特菌感染部位，并促进其抗菌功能。

研究团队采用多种关键技术方法展开研究。通过CRISPR/Cas9技术构建Gpr35基因敲除小鼠模型，利用流式细胞术分析不同组织单核细胞亚群分布。采用李斯特菌口服和静脉感染模型评估体内细胞迁移和细菌清除能力。通过静态细胞粘附实验分析整合素功能，运用离子色谱-高分辨质谱（IC-HR-MS）和基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）技术检测代谢物空间分布。此外，还通过细胞内染色和抗体阻断实验评估细胞因子产生和分子机制。

GPR35是单核细胞选择性表达的GPCR

研究人员首先检测了GPR35在不同白细胞亚群的表达模式。结果显示，Gpr35在循环中的Gr-1^hi和Gr-1^lo单核细胞中均有特异性表达，而在骨髓中的Ly6C^hi单核细胞中表达水平较低，表明Gpr35表达随着单核细胞成熟而诱导上调。Gpr35缺陷不影响单核细胞稳态发育和基础迁移，在硫乙醇酸盐诱导的无菌性腹膜炎模型中，Gpr35^-/-小鼠的单核细胞招募能力与野生型相当，提示GPR35在无菌性炎症中并非必需。

GPR35介导肠道单核细胞招募

为模拟自然感染途径，研究人员通过口服途径接种李斯特菌。结果显示，在盲肠和结肠中，Gpr35^+/+小鼠的Ly6C^hi单核细胞招募显著增加，而Gpr35^-/-小鼠则明显减少。相反，在回肠中单核细胞招募程度较低且不受GPR35缺失影响，这与不同肠段李斯特菌感染效率差异相关。

GPR35促进单核细胞向肝脏和脾脏迁移

静脉感染模型进一步证实了GPR35的重要性。感染后第4天，Gpr35^-/-小鼠肝脏和脾脏中Ly6C^hi单核细胞招募显著减少，而外周血中该细胞数量相应增加，表明GPR35缺陷导致单核细胞从循环向感染部位迁移受阻。免疫染色显示，Gpr35^+/+小鼠的Ly6C^hi单核细胞主要位于门静脉和肝窦附近的实质区域，而Gpr35缺失显著减少单核细胞向实质的浸润。

GPR35信号激活整合素依赖性细胞粘附

机制研究表明，GPR35激动剂Zaprinast可诱导野生型单核细胞与ICAM-1（细胞间粘附分子-1）的粘附增强，而Gpr35缺陷则完全阻断此效应。中和抗体实验证实，Mac-1（CD11b/CD18）和LFA-1（CD11a/CD18）两种β2整合素均参与GPR35介导的粘附过程。体内实验进一步证明，抗ICAM-1抗体可抑制野生型小鼠单核细胞招募，但对Gpr35^-/-小鼠无附加效应，表明GPR35信号通过整合素激活调控单核细胞迁移。

LPA在感染灶附近积累

代谢组学分析发现，李斯特菌感染导致血浆中色氨酸水平显著降低，犬尿氨酸增加，但GPR35的已知配体犬尿酸和5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）并未增加。成像质谱技术显示，LPA（18:1）和LPA（20:4）在炎症血管附近区域特异性积累，且单核细胞浸润主要发生在这些LPA信号富集区域，提示LPA可能作为GPR35配体指导单核细胞招募。

GPR35增强单核细胞TNF-α产生

功能研究表明，感染后第4天，外周血和肝脏中绝大多数Ly6C^hi单核细胞表达Sca-1标志。Gpr35缺陷导致肝脏Sca-1⁺单核细胞减少，而外周血相应增加。重要的是，GPR35信号显著促进Sca-1⁺单核细胞产生TNF-α，但不影响iNOS表达，表明GPR35特异性调控单核细胞的炎症因子产生功能。

GPR35限制细菌负荷

最终，Gpr35缺陷显著增加口服和静脉感染模型中李斯特菌在肠道、肝脏和脾脏的负荷，证实GPR35信号在宿主防御中的关键作用。即使在单核细胞招募不受影响的小肠段，GPR35缺失仍导致细菌清除能力下降，凸显GPR35依赖的TNF-α产生在抗菌免疫中的重要性。

本研究系统阐明了GPR35在单核细胞介导的抗感染免疫中的核心作用。GPR35通过双重机制发挥作用：一方面激活整合素依赖性粘附，促进单核细胞向感染部位迁移；另一方面增强TNF-α产生，直接强化抗菌功能。LPA作为潜在内源性配体，在感染灶局部积累，为GPR35激活提供空间信号。这一发现不仅深化了对单核细胞招募机制的理解，也为治疗李斯特菌等胞内病原体感染提供了新的分子靶点。鉴于单核细胞在多种病原体清除中的普遍作用，GPR35信号通路可能成为广谱抗感染策略的潜在干预靶标。