基于等温滴定量热法的RUBISCO特异性常数Γ测定新方法及其在酶工程中的应用

《Photosynthesis Research》：Calculation of specificity constants Γ for RUBISCO of different species from microcalorimetric data

本研究针对传统放射性标记法测定RUBISCO特异性常数Γ的效率低、成本高问题，开发了通过等温滴定量热法（ITC）测量反应焓变ΔrH随底物浓度比ρ（[CO2]/[O2]）变化的创新方法。该方法通过热力学参数推算Γ值，为高通量筛选高特异性RUBISCO变体提供了安全经济的替代方案，对作物增产工程具有重要应用价值。

　　

在植物光合作用的核心环节，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RUBISCO）扮演着双重角色——既能催化二氧化碳（CO₂）的羧化反应推动碳固定，又能催化氧气（O₂）的加氧反应引发光呼吸。这种底物竞争特性使得RUBISCO成为决定作物光合效率的关键靶点。然而，传统测定其特异性常数Γ（即酶区分CO₂与O₂能力的关键参数）的方法长期依赖放射性同位素标记技术，不仅成本高昂、操作繁琐，更严重制约了高通量筛选优良RUBISCO变体的研究进程。

为突破这一技术瓶颈，Joachim Frank与Frank Müh在《Photosynthesis Research》发表的研究中，开创性地利用等温滴定量热法（ITC）建立了Γ值的非放射性测定体系。该方法基于一个巧妙的发现：RUBISCO催化反应的总焓变Δ_rH会随气相底物浓度比ρ（[CO₂]/[O₂]）发生规律性变化。通过解析这种热力学响应关系，研究者成功实现了对羧化反应焓变Δ_r,cH和加氧反应焓变Δ_r,oH的分离测定，进而推导出精确的Γ值。

研究方法的核心在于巧妙的实验设计。研究人员通过调节NaHCO₃浓度控制CO₂分压，在固定O₂浓度（0.3 mM）条件下，利用ITC仪器测量系列ρ值对应的Δ_rH。为保障酶充分活化，采用高浓度RUBISCO样品（RuBP/酶分子比为1-2.5），并特别关注低CO₂浓度（<10 μM）下内源性CO₂的干扰排除。通过外推法确定ρ→0时的Δ_r,oH（-401 kJ/mol）和ρ→∞时的Δ_r,cH（-62.3 kJ/mol），为Γ值计算提供了关键参数。

结果部分通过理论推导与实验验证相结合，建立了完整的Γ值计算模型。研究团队首先从酶动力学基本公式出发，推导出羧化反应占比x与Γρ的数学关系（x = Γρ/(1+Γρ)），进而构建总反应焓变与分反应焓变的加权求和公式（Δ_rH = xΔ_r,cH + (1-x)Δ_r,oH）。以菠菜RUBISCO为例，当以Mg²⁺为辅因子时，Γ=80对应的Δ_rH随ρ升高呈现显著下降趋势（从ρ=0.000833时的-379 kJ/mol降至ρ=3.333时的-63.56 kJ/mol），这种剧烈变化为精确测定提供了理想信号窗口。

最具创新性的成果体现在Γ值的实操测定方案。研究者提出通过转换计算获得x/(1-x)值与ρ的线性关系，其斜率即为待测Γ值。如图2所示，对菠菜RUBISCO的实测数据进行线性回归，得到Γ=80.4±0.1，与文献报道值高度吻合。该方法成功将复杂的酶动力学参数测定转化为直观的热力学测量，显著提升了检测效率。

讨论部分深入阐释了该方法的科学价值与应用前景。值得注意的是，加氧反应巨大的放热特性（Δ_r,oH = -401 kJ/mol）远超羧化反应，这与其通过过氧化物中间体进行的能量富集过程密切相关，也解释了Mn²⁺激活酶为何能观测到化学发光现象。ITC方法的优势在于2%的Δ_r,oH测量误差和1%的Δ_r,cH误差控制，保证了Γ值计算的可靠性。与需要产物定量的传统方法相比，这种直接测量热效应的方案避免了复杂的分离鉴定步骤，有效降低了系统误差。

该研究的重要意义在于为RUBISCO工程提供了高效筛选工具。通过ITC技术快速评估不同来源酶的Γ值，能够加速筛选具有高羧化/加氧比特性的优良变体，为设计高光效作物提供靶点。未来结合反应中心结构解析，这一方法有望在提升作物产量方面发挥关键作用，推动光合作用研究进入精准设计的新阶段。