APC基因c.1744G>C错义变异通过诱导外显子14异常剪接导致家族性腺瘤性息肉病

《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》：The c.1744G?>?C, p.(Glu582Gln) missense variant in coding exon 14 of APC increases skipping of a natural occurring isoform and causes Familial Adenomatous Polyposis

本刊推荐：为解决APC基因意义未明变异(VUS)致病性判定难题，研究人员开展c.1744G>C变异致病机制研究，通过RNA分析发现该变异通过增强编码外显子14跳跃率(90% vs 60%)产生截短蛋白p.(Glu582Alafs*20)，首次证实内含子13-外显子14交界区变异可导致家族性腺瘤性息肉病(FAP)，为ACMG分级提供关键证据。

　　

在遗传性结直肠癌研究领域，家族性腺瘤性息肉病(Familial Adenomatous Polyposis, FAP)始终是学者们关注的焦点。这种常染色体显性遗传综合征以结直肠内成百上千的腺瘤性息肉为特征，患者如未接受干预，终生罹患结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的风险极高。其致病基因APC作为重要的肿瘤抑制因子，通过调控β-catenin(β-连环蛋白)降解复合体的形成，在Wnt信号通路中扮演着"刹车"角色。然而，临床遗传诊断实践中常会遇到棘手的"灰色地带"—意义未明变异(Variants of Unknown Significance, VUS)，这些基因改变既不能简单归类为良性，也无法直接判定为致病性，给患者家族的风险评估和临床管理带来巨大挑战。

特别值得注意的是，APC基因的表达调控机制极为复杂。该基因通过选择性剪接(alternative splicing)产生多种蛋白质异构体，其中编码外显子14(按转录本编号为第15外显子)的自然跳跃现象尤其引人关注。正常情况下，约60%的APC转录本会发生该外显子的跳跃，产生含有提前终止密码子的异构体p.(Glu582Alafs*20)。由于该终止密码子位于最后一个外显子，这些转录本可逃避无义介导的mRNA降解(Nonsense-Mediated mRNA Decay, NMD)机制，最终表达出功能异常的截短蛋白。既往研究已发现外显子14的3'区域某些变异会影响剪接，但关于内含子13与外显子14交界区域的变异研究尚属空白。

针对这一科学问题，丹麦研究团队在《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》发表了最新成果。研究人员通过对两个无关FAP家系的基因检测，锁定了一个位于APC基因外显子14首位的c.1744G>C错义变异。尽管该变异在ClinVar数据库中仅被标注为VUS，但家系调查显示其与疾病表型共分离：家系I中7名变异携带者出现4例结直肠癌(45-61岁发病)，家系II先证者46岁确诊结直肠癌并携带11个腺瘤。这种表型异质性非常显著，既有典型FAP表现(>70个腺瘤)，也有衰减型FAP(Attenuated FAP, AFAP)特征(<10个腺瘤)。

研究团队运用多项关键技术验证变异功能效应：首先利用生物信息学工具(MaxEntScan和SpliceAI)预测变异对剪接位点强度的影响；随后通过淋巴母细胞系(Lymphoblastoid Cell Lines, LCLs)培养获取研究对象RNA样本；采用逆转录PCR(RT-PCR)结合三代纳米孔测序(Nanopore sequencing)技术进行转录本分析；使用Minimap2进行序列比对并通过ggsashimi软件可视化剪接模式。为评估NMD效应，实验还设置了NMD抑制剂(NMDi)对照组。

RNA分析揭示致病机制

功能实验证实，c.1744G>C变异位于外显子14首个核苷酸(-1位置)，导致剪接受体强度显著降低(MaxEntScan评分从10.0降至6.8)。SpliceAI预测显示该变异同时影响受体和供体位点(得分分别为0.35和0.30)。纳米孔测序结果更直观显示，变异携带者中外显子14跳跃转录本比例高达90%，显著高于对照组的60%。尽管PCR反应可能对较短片段存在扩增偏好，但如此显著的差异足以证明变异对剪接的实质性影响。

变异重新分类与临床意义

基于RNA证据，研究人员依据ACMG APC特异性指南将变异重新分类为可能致病(Class 4)。关键证据包括：PM2_SUP(人群数据库未见报道)、PP1_MOD(家系共分离)、PS3_SUP(RNA剪接异常)和PS4_MOD(患者符合FAP/AFAP诊断标准)。这一重新分类为两个家系提供了明确的遗传咨询依据，凸显功能验证对VUS临床解读的重要性。

表型异质性与分子机制探讨

研究观察到该变异呈现显著表型异质性：家系I中多数携带者腺瘤数量<30个，呈现AFAP特征；而家系II先证者兄弟姐妹却出现60-100个腺瘤。这种变异性与APC基因其他区域变异报道一致，特别是5'区域(密码子1-233)、外显子9选择性剪接区(密码子311-412)及密码子1595以远区域。值得注意的是，所有变异携带者均未出现十二指肠外腺瘤或硬纤维瘤等结肠外表现，这可能与特定异构体的组织特异性功能有关。

研究局限与展望

本研究主要局限在于使用淋巴母细胞系而非结肠上皮细胞进行RNA分析。尽管血液来源RNA已成功用于鉴定多个APC剪接变异(如c.1956C>T, p.(His652=)和c.1957A>G, p.(Arg653Gly))，但组织特异性剪接调控机制仍需进一步探索。未来利用类器官模型或直接分析患者结肠组织将提供更精准的功能证据。

本研究首次证实APC基因内含子13-外显子14交界区的错义变异可通过破坏剪接调控导致FAP，扩展了该基因的致病变异谱系。这一发现强调了对疑似遗传性肿瘤患者进行综合分子分析的重要性——不仅需要DNA层面检测，更应结合RNA功能研究破解VUS的临床意义。随着精准医疗时代的到来，类似多层次证据整合策略将为更多遗传性肿瘤综合征的分子诊断提供范本，最终实现从"基因序列"到"临床意义"的精准解读。