DLL4介导髓源性抑制细胞代谢重编程促进Titin失活三阴性乳腺癌新辅助治疗耐药机制研究

《Molecular Biomedicine》：Delta-like ligand 4 mediated myeloid-derived suppressor cell metabolic reprogramming promotes neoadjuvant therapy resistance in titin-inactivated triple-negative breast cancer

本研究针对三阴性乳腺癌(TNBC)治疗耐药难题，揭示了TTN失活通过DLL4-NOTCH2-MCT4轴驱动髓源性抑制细胞(MDSCs)糖酵解代谢重编程的新机制。研究人员通过多组学测序和基因编辑技术证实，TTN缺陷/突变通过转录因子NANOS1上调DLL4表达，激活MDSCs中NOTCH2信号通路促进MCT4介导的乳酸代谢，最终导致肿瘤干细胞特性增强和CD8+ T细胞功能抑制。该发现为TNBC靶向免疫治疗提供了新策略，相关成果发表于《Molecular Biomedicine》。

　　

三阴性乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌中最具侵袭性的亚型，因其缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2表达靶点，对内分泌治疗和靶向治疗不敏感，长期以来主要依赖化疗手段。然而，临床实践中发现TNBC患者对新辅助化疗方案如Nab-PTX（白蛋白结合型紫杉醇）普遍存在耐药现象，导致病理完全缓解率低、复发转移风险高。近年来，免疫检查点抑制剂虽然为部分TNBC患者带来希望，但总体响应率仍不理想，这表明TNBC的免疫抑制微环境存在复杂调控机制亟待解析。

在这一背景下，TTN（Titin）基因的异常表达引起了研究者关注。TTN作为人类基因组中最大的蛋白质编码基因，其突变在TNBC中频繁发生，且与不良预后相关。然而，TTN失活（包括表达缺陷和突变）如何影响肿瘤微环境重塑及治疗耐药的具体机制尚不明确。杨艳芳等研究人员在《Molecular Biomedicine》上发表的最新研究，正是针对这一科学问题展开的系统性探索。

本研究主要采用多中心临床样本队列与多组学技术相结合的研究策略。技术体系包括：① 全外显子测序和RNA测序分析20例TNBC患者基因突变谱和表达特征；② 单细胞转录组测序解析TTN突变与野生型肿瘤的免疫细胞组成差异；③ CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TTN突变/敲除的TNBC细胞系模型；④ 患者来源类器官（PDO）与外周血单个核细胞（PBMCs）共培养系统模拟肿瘤-免疫相互作用；⑤ 空间转录组和多重荧光免疫组化技术定位关键分子在肿瘤组织中的空间分布；⑥ 染色质免疫共沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因实验验证转录调控机制。

Multicenter exon nucleotide sequencing was conducted to obtain the target gene TTN

研究人员首先通过对20例TNBC患者的全外显子测序发现TTN是高频突变基因，且TTN突变型肿瘤富集于糖酵解-糖异生通路。类器官-PBMCs共培养实验显示TTN突变型类器官对Nab-PTX更具耐药性，但这种耐药性依赖于微环境重塑。整合TCGA和CPTAC数据库的100例TNBC数据进一步证实TTN突变与协同耐药相关，并定义了"TTN失活"状态（TTN表达量FPKM<0.07或错义突变）。

Glycolytic myeloid-derived suppressor cells were enriched in TTN-inactivated triple-negative breast cancer to promote tumor progression

单细胞转录组测序揭示TTN突变型肿瘤中髓源性抑制细胞（MDSCs）显著富集，且功能性和记忆性CD8⁺ T细胞比例下降。多重荧光染色证实MDSCs在TTN突变肿瘤中与肿瘤细胞空间相邻。代谢分析显示TTN突变型MDSCs呈现更强的糖酵解表型，线粒体活性抑制，且ARG1⁺和iNOS⁺ 免疫抑制亚群比例升高。

DLL4 was essential for TTN inactivation, which enhanced tumorigenesis

通过CRISPR-Cas9构建TTN突变型MDA-MB-231细胞系，RNA测序发现DLL4（Delta-like ligand 4）是TTN失活肿瘤中最显著上调的细胞因子。实验验证DLL4在TTN突变型细胞系和患者来源异种移植（PDX）模型中高表达。单细胞测序显示DLL4⁺肿瘤上皮细胞具有高干性特征，多重染色证实DLL4与EpCAM在TTN低表达肿瘤细胞中共定位。动物实验表明DLL4敲除显著减少MDSCs浸润和肿瘤负荷。

TTN inactivation regulated DLL4 expression via the transcription factor NANOS1

pySCENIC转录因子分析发现NANOS1在TTN缺陷癌细胞中显著富集。实验证实NANOS1与DLL4启动子区域（-858至-838 bp）直接结合，荧光素酶报告基因显示NANOS1过表达增强DLL4转录活性。TTN缺失通过NANOS1上调DLL4表达，而NANOS1敲除则逆转此效应。临床样本显示NANOS1高表达与不良预后相关。

DLL4induced MCT4-mediated glycolytic reprogramming and pro-tumorigenic MDSCs in TNBC with TTN inactivation

机制研究发现，TTN失活癌细胞通过分泌DLL4激活MDSCs中NOTCH2信号通路，进而上调单羧酸转运蛋白4（MCT4）表达，促进糖酵解代谢。流式细胞术显示TTN突变患者来源MDSCs高表达MCT4。NOTCH2特异性抑制剂OMP-59R5（tarextumab）或MCT4抑制剂VB-124处理可逆转DLL4诱导的MDSCs糖酵解重编程和促肿瘤表型。

DLL4-NOTCH2-MCT4 axis induced MDSCs glycolysis to promote tumorigenesis

KEGG富集分析证实NOTCH信号通路与DLL4过表达显著相关。单细胞测序检测到上皮细胞与MDSCs间DLL4-NOTCH2配体-受体信号对。ChIP实验证明NOTCH信号转录调节因子RBPJ直接促进MCT4转录。氧消耗率（OCR）检测显示tarextumab和VB-124通过阻断DLL4诱导的MDSCs耗氧量逆转糖酵解活性。

TTN inactivation-derived DLL4 remodeled the anti-tumor immune microenvironment through MCT4+ MDSC-CD8+T

研究发现TTN突变肿瘤中CD8⁺ T细胞衰竭标志物（PDCD1、CTLA4、LAG3、HAVCR2）表达升高，细胞毒性T细胞浸润减少。MDSCs-T细胞共培养实验表明TTN失活来源MDSCs显著抑制T细胞增殖和IFN-γ产生，而DLL4缺失可逆转此抑制效应。MCT4基因敲除MDSCs增强T细胞抗肿瘤功能。

Glycolytic MDSCs promoted TNBC resistant to Nab-PTX+pembrolizumab

Nab-PTX+pembrolizumab处理后，TTN敲除癌细胞与MDSCs共培养显示凋亡减少、CD24⁺CD44⁺干细胞亚群增加。ATAC测序发现TTN突变_MDSCs组显著上调干性相关转录因子（SOX9、SOX2）启动子区域染色质开放状态。H3K18la组蛋白乳酸化修饰分析证实MDSCs通过p300介导的H3K18la修饰促进肿瘤干细胞特性，导致治疗耐药。

Blocking the DLL4-MCT4 axis may sensitize chemotherapy and immunotherapy in TTN-inactivated TNBC

动物实验证实，4T1-TTN敲除肿瘤对Nab-PTX+pembrolizumab联合治疗产生耐药。而DLL4中和抗体enoticumab或MCT4抑制剂VB-124与免疫化疗联用，可显著抑制肿瘤生长、减少MDSCs浸润。在MCT4fl/fl基因工程小鼠模型中，TTN失活肿瘤对治疗敏感性恢复。临床样本分析显示DLL4⁺肿瘤细胞比例与新辅助治疗不良反应正相关，且DLL4高表达患者无复发生存和总生存期更短。

本研究系统阐明了TTN失活通过NANOS1-DLL4-NOTCH2-MCT4信号轴驱动MDSCs代谢重编程的新机制，揭示了TNBC免疫抑制微环境形成和治疗耐药的关键环节。值得注意的是，TTN作为人类最大蛋白质，其功能缺失可能通过基因组不稳定性间接影响肿瘤生物学行为，而本研究聚焦于其免疫调控功能，为理解TTN非经典功能提供了新视角。

讨论部分指出，DLL4-NOTCH2轴通过血管生成和免疫调节双重机制影响肿瘤进展。在TTN突变TNBC中，NOTCH2激活促进MDSCs极性转化，通过MCT4上调增强糖酵解代谢，形成酸性免疫抑制微环境。虽然DLL4抑制剂在临床试验中显示血管正常化作用，但其毒性支持靶向下游效应分子如MCT4的替代策略。

该研究的临床