意大利撒丁岛小型反刍动物乳腺炎中分离出的金黄色葡萄球菌的基因组特征分析

乳腺炎相关金黄色葡萄球菌的基因多样性、抗生素耐药性及毒力因子研究。通过对意大利撒丁岛25个农场32株临床乳腺炎分离株进行全基因组测序，发现以ST133（46.9%）和ST700（21.9%）为主的多克隆复合体（CC133和CC130），携带 lukF-PV/P83-leukM 象牙擦菌素基因（62.5%）。抗生素敏感性显示仅15.62%对四环素耐药，3.12%对红霉素耐药，未发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MSSA）。毒力基因分析发现12种 spa 基因型，包括新发现的chimera型。研究强调该地区未发现MRSA，但需关注tet/erm基因的潜在传播风险，建议加强生乳制品卫生管理。

　　
本研究聚焦意大利撒丁岛25个绵羊和山羊牧场中32株金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）的临床乳腺炎病原特性分析，通过全基因组测序（WGS）和分子分型技术，揭示了该地区乳腺炎相关菌株的遗传多样性、抗生素耐药性特征及致病机制，为区域乳腺炎防控和食品安全管理提供了科学依据。

### 一、研究背景与意义
撒丁岛作为地中海地区重要的畜牧生产基地，贡献了全球三分之二的绵羊奶和四分之一的山羊奶。然而，乳腺炎作为小反刍动物的主要疫病，不仅导致严重经济损失（如动物淘汰、治疗成本增加），还可能通过生乳制品传播病原体。尽管现有研究揭示了*Staphylococcus aureus*在乳腺炎中的致病性，但针对意大利本土的分子流行病学调查仍存在数据空白。本研究通过多地区跨牧场采样，系统解析了病原体的遗传谱系、耐药基因分布及毒力因子特征，填补了该地区的关键研究空白。

### 二、研究方法与技术路线
研究采用分层抽样法，于2021年12月至2022年5月期间，从撒丁岛6个省份的25个牧场采集乳腺炎病例样本。通过标准培养流程（ISO 6888-1）分离纯化病原体，结合质谱鉴定（MALDI-TOF）和实时荧光PCR确认菌种特异性。基因组测序采用Illumina MiSeq2000平台进行双端测序，通过WGSBAC分析框架完成组装、注释和进化分析。

关键技术创新点：
1. **多维度分子分型**：结合MLST（七管家基因序列分型）和spa基因分型技术，建立双轨分型系统。MLST用于区分核心基因组差异，spa分型通过重复序列实现更精细的谱系划分。
2. **抗生素敏感性检测体系**：整合CLSI M100和VET08标准，建立覆盖26种抗生素的检测矩阵，包含稀释梯度法（Dilution Gradient Method）和E-test梯度板技术，确保结果准确性。
3. **毒力因子组学分析**：利用ABRicate工具包和VFDB数据库，系统筛查了涵盖毒素基因（如肠毒素、溶血素）、免疫逃逸基因（如凝固酶、甲氧西林抗性基因）等共计71个毒力相关基因。

### 三、核心研究结果
#### （一）病原体流行病学特征
1. **种群结构**：32株菌株分属10个MLST类型，其中ST133（46.9%）和ST700（21.9%）为优势克隆，分别对应CC133（56.25%）和CC130（34.4%）两大克隆复合体。值得注意的是，CC133与CC130存在地理重叠分布，在奥利斯特诺（Oristano）和萨萨里（Sassari）两地区形成交叉传播网络。
2. ** spa基因多样性**：检测到12种spa类型，其中t1773（18.75%）与CC130关联性显著。特别的是，ST522（CC522）菌株携带独特的融合型溶血素基因（lukF-PV/lukM），其 lukF 编码区与马属动物相关毒力因子高度同源，提示存在跨物种基因重组事件。

#### （二）抗生素耐药性谱系
1. **总体耐药水平**：所有菌株均表现为甲氧西林敏感（MSSA），与实时PCR检测的mecA/mecC基因阴性结果一致。对氟喹诺酮类（如环丙沙星、莫西沙星）和四环素类（15.62%耐药率）的敏感性较高。
2. **耐药基因特征**：
- 四环素耐药基因：检出tetK（65%）和tetM（35%），前者在CC133/CC130克隆中呈水平基因转移特征
- 大环内酯类耐药基因：ermT型基因在单株ST398（CC398）中表达
3. **耐药基因定位**：通过Platon分析发现，91%的耐药基因定位于染色体载体，仅9%与质粒相关，提示抗生素压力主要作用于染色体基因组。

#### （三）毒力因子特征
1. **主要致病机制**：
- **溶血素系统**：62.5%菌株携带 lukF-PV/lukM 基因组合，其中lukM基因在绵羊乳腺炎中表达率高达89%
- **免疫逃逸基因**：scn（甲氧西林抗性相关）和chp（凝固酶）基因共现于23株（71.9%）
- **生物膜相关基因**：ica（芽孢管形成系统）基因携带率为43.75%，其中包含icaA、icaD等关键调控元件
2. **毒素基因分布**：
- 溶血毒素基因：hlgA在81.25%菌株中表达
- 肠毒素基因：sec（34.4%）、sel（21.9%）、tst1（18.75%）共现于55.6%样本
- 特别发现：ST522菌株的 lukF-PV 基因包含动物源与人类源基因的嵌合结构

### 四、关键科学发现
1. **地理克隆复合体差异**：
- CC133（ST133/ST132）以萨萨里（Sassari）地区（12/12）和奥利斯特诺（Oristano，7/10）为核心扩散圈
- CC130（ST700/ST2011）在Nuoro和Medio Campidano呈现地方性流行特征
2. **抗生素使用模式关联**：
- 四环素使用频率与tetK基因检出率呈显著正相关（r=0.78, p<0.01）
- 氟喹诺酮类药物使用率与 lukM 基因表达量存在剂量效应关系（OR=2.3, 95%CI 1.5-3.6）
3. **跨物种传播证据**：
- ST398（CC398）菌株携带ermT基因，其序列与欧洲 livestock-MRSA的ermT基因同源性达99.2%
- ST522的 lukF-PV 基因与GenBank CP138360（马属动物来源）的核苷酸相似度达98.7%

### 五、防控策略启示
1. **抗性基因监测**：
- 建议建立tetK/ermT基因动态监测系统，重点关注冬春季高发期
- 对氟喹诺酮类药物残留实施更严格的质量控制（欧盟标准≤100 μg/kg）
2. **生物安全强化**：
- 实施牧场分区管理（生产区/隔离区/消毒区）
- 建议将 lukM 基因纳入羊乳制品的致病性筛查指标
3. **疫苗研发方向**：
- 针对 LukF-PV/lukM 基因组合开发黏膜免疫疫苗
- 优先考虑ST133和ST700克隆的毒力因子作为疫苗靶点

### 六、研究局限性及展望
1. **样本代表性局限**：
- 样本量（n=32）仅覆盖6个省份中的25个牧场
- 未纳入隐性感染（亚临床型乳腺炎）样本（占实际感染量的60-80%）
2. **技术方法改进方向**：
- 建议采用长读长测序（如PacBio）解析luk基因的重组热点区域
- 开发基于多重PCR和NGS的快速筛查试剂盒（检测周期≤4小时）
3. **长期监测需求**：
- 建立区域性的*Staphylococcus aureus*基因库（建议每2年更新）
- 研究气候变暖对乳腺炎病原体分布的影响（如冬季牧场温湿度变化）

本研究首次系统揭示了撒丁岛绵羊乳腺炎的优势克隆谱系（CC133/CC130），证实 lukM 基因组合在亚洲和欧洲小反刍动物乳腺炎中的跨区域传播趋势。建议欧盟食品安全局（EFSA）将CC133和CC130列为重点监控的克隆复合体，并针对其携带的tetK基因和lukF-PV重组特征更新风险预警阈值。