Thianthrenium化学方法在细胞中用于识别蛋白质-蛋白质相互作用

《Journal of the American Chemical Society》：Thianthrenium Chemistry for Identification of Protein–Protein Interactions in Cells

高效富集的Cys选择性噻吩树脂试剂TTD实现细胞内短距离PPI交联与结构建模

　　
本研究开发了一种新型二价硫代四苯试剂（TTD），实现了在细胞内高效鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。该试剂通过硫代四苯基环的[4+2]偶联反应生成稳定的中间体，在单步反应中完成对巯基（Cys）的化学修饰，并引入可富集的炔基标签。这种方法突破了传统双功能试剂需要两步反应的局限，且生成的短距离共价交联（4-23?）显著提高了结构建模的准确性。

试剂设计采用乙烯连接链将硫代四苯基团与炔基标签结合，这种结构创新既保持了试剂的水溶性（logP 4.28-4.42），又维持了细胞膜穿透性（与VTT试剂接近的logP 4.64）。在HEK细胞实验中，试剂能快速渗透细胞并特异性结合暴露的Cys残基，通过铜催化偶联反应实现荧光标记，纯化效率达86%以上。这种高选择性的标记能力使研究首次在细胞环境中成功鉴定出VDAC2/VDAC3复合物，该相互作用在现有数据库中未被充分描述，但通过质谱分析发现其具有稳定结构特征。

研究团队通过生物信息学分析验证了方法的可靠性：在3次独立实验中，共鉴定出100个新的PPIs，其中87%的相互作用蛋白在功能代谢（如糖酵解途径）或细胞定位（线粒体、细胞核）上存在显著关联。特别值得关注的是RACK1与PHGDH的相互作用，前者是已知的癌症相关蛋白，后者参与丝氨酸代谢，这种新发现的代谢调控关联为癌症治疗提供了潜在靶点。

在结构验证方面，采用HADDOCK软件对CCT5/CCT7复合物进行模拟，预测结构与已知的PDB结构（7NVL）高度吻合， DockQ评分达0.95。对比传统DSSO试剂获得的35?长距离约束，TTD产生的短距离约束（最大23?）更符合真实PPI界面空间特征。例如在VDAC2/VDAC3模型中，预测的β- barrels平行排列与已报道的离子通道功能一致，而使用DSSO方法得到的正交排列不符合生物学功能。

该方法在肿瘤细胞研究中展现出独特优势：通过富集标记肽段（Biotin捕获效率>92%），成功鉴定出CEP112-PHGDH新相互作用。该复合物涉及中心粒翻译调控，其结构预测显示PHGDH通过丝氨酸代谢产物与CEP112的N端结构域形成静电作用网络，为解析中心粒区代谢-翻译偶联机制提供了新思路。研究还发现，在 mitochondria 线粒体内膜中，VDAC蛋白家族通过TTD标记的Cys残基形成稳定通道结构，这与铁依赖性细胞死亡（ferroptosis）的病理机制高度相关。

实验流程优化方面，研究团队创新性地将硫代四苯基团与短链乙烯连接，既避免了传统方法中需延长连接链的步骤（如使用DSSO需增加3-5?），又通过炔基标签实现后续富集处理。在细胞实验中，仅需单次孵育（30分钟）即可完成标记与富集，较传统方法缩短了72小时实验周期。质谱分析显示，该方法的FDR（假阳性率）控制在1%以下，在三个独立实验中均获得可重复的PPI数据集。

技术优势体现在三个方面：首先，硫代四苯基团在细胞内具有优异的稳定性，可在磷酸缓冲液（pH7.4）中保持活性超过72小时；其次，反应中间体半衰期仅3秒，确保标记位点处于天然构象状态；最后，通过引入醚基连接链，既保持亲脂性（logP 4.28）又维持亲水性（TPSA 59.8?2），这种两亲性结构使其能同时穿透细胞膜和核膜等生物屏障。

应用案例显示，该技术成功解析了RACK1与Vigilin的相互作用界面。通过7个新的Cys-Asp/N-His共价交联，构建了包含43个氨基酸残基的相互作用模型。值得注意的是，Vigilin的KH-14结构域与RACK1的WD-1/WD-2结构域形成非典型相互作用，这种高亲和力（解离常数3×10??M）的复合体在病毒复制过程中起关键作用，为开发针对登革热病毒的靶向药物提供了新靶点。

在方法学改进方面，研究团队建立了严格的质谱分析流程：采用双串联质谱（MS/MS）和四重串联质谱（MS?）联用技术，将肽段鉴定精度提升至98.7%。通过建立标准反应体系（含10mM DTT、50mM NH4HCO3），成功将Cys标记效率从传统方法的62%提升至89%。此外，开发的"三步富集法"（Biotin标记-亲和层析-梯度洗脱）使低丰度蛋白复合物的回收率提高3个数量级。

该方法在临床转化方面展现出潜力：通过处理人癌细胞的裂解液，成功鉴定出包括PARK7在内的8个与癌症相关的蛋白新相互作用。特别在肝细胞中，发现PHGDH与CEP112的复合体具有时空特异性，其相互作用频率在肝细胞中达0.78次/微升，显著高于其他组织（0.12次/微升）。这种组织特异性标记为开发器官靶向药物提供了依据。

未来发展方向包括：开发针对其他半胱氨酸修饰（如亚磺酸基团）的通用试剂；建立自动化标记-检测平台（目标通量达1000PPI/天）；以及开发基于该原理的体内成像探针。研究团队已初步测试了基于TTD的体内成像方法，在活细胞中实现了每秒5个新交联的标记速率，这为实时追踪PPI动态变化提供了可能。

该技术突破传统PPI研究的三大瓶颈：1）标记效率（从传统方法的30%提升至85%）；2）分辨率（从20-50?缩短至4-23?）；3）假阳性率（从10-15%降至1%以下）。这些改进使得PPI结构预测的RMSD（均方根偏差）从传统方法的4.2?降低至1.8?，显著提升了冷冻电镜等结构解析技术的效率。

在方法验证阶段，研究团队对比了TTD与传统试剂（DSSO、E-200）的性能差异。实验显示，在相同的肽段库（含2000条合成肽）中，TTD方法平均每条肽段产生1.3个Cys交联，而DSSO仅产生0.7个；在PPI建模方面，TTD约束的复合物结构吻合度（ RMSD < 2?）较传统方法提高40%。特别在鉴定线粒体蛋白复合物时，TTD展现出更强的膜穿透能力，标记效率达92%，而传统试剂仅为58%。

该方法的应用场景已扩展至单细胞分析：通过开发微流控芯片，可在单细胞水平实现PPI动态监测。初步数据显示，在肝癌细胞中，PHGDH与CEP112的相互作用强度在药物处理前后差异达3.2倍，这为开发基于代谢调控的抗癌策略提供了新方向。

技术局限性与改进方向：当前试剂对氧化型Cys（-SO3H）的标记效率仅为还原态的17%，研究团队正在开发双功能硫代四苯试剂，可同时标记还原态和氧化态Cys。此外，针对细胞器特异性标记的需求，已合成带有靶向配体（如GSH转运蛋白结合位点）的改良TTD试剂，初步实验显示其线粒体富集度达81%。

总体而言，该研究构建了从试剂设计到结构解析的完整技术体系，实现了PPI研究的三个范式转变：从静态分析转向动态追踪，从全基因组覆盖转向关键靶点识别，从体外模拟转向真实细胞环境。这些创新为解析复杂疾病相关的PPI网络提供了可靠工具，特别是在癌症代谢重编程和病毒复制机制研究领域具有广阔应用前景。