利用超声-微波辅助的固化悬浮有机液滴微萃取技术结合比色分析方法提高牛奶中组胺的检测灵敏度

《International Dairy Journal》：Enhanced Detection of Histamine in Milk Using Ultrasound-Microwave-Assisted Solidified Floating Organic Droplet Microextraction Coupled with Colorimetric Analysis

组胺快速检测新方法：超声-微波辅助固体浮滴液相微萃取联用紫外可见光谱法，显著提升灵敏度（LOD 0.14 mg/L）和准确性，有效解决乳制品基质干扰，实现绿色低成本检测。

　　

谢志新|张怀杰|李建平|刘思远|庞明尧|田波|刘振民

国家乳品生物技术重点实验室，上海乳品生物技术工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳品研究所，上海200436，中国

摘要

本研究通过创新地将经典的His-azo化合物比色法与超声波-微波辅助的固化浮选有机滴液相微萃取（UMA-SFOD-LPME）和低温离心技术相结合，开发出一种高灵敏度且简单的牛奶中组胺（His）检测方法。该方法首先形成有色His-azo化合物，通过UMA-SFOD-LPME进行富集，随后通过低温离心分离萃取溶剂，并利用紫外-可见（UV-Vis）光谱法进行定量分析。UMA-SFOD-LPME是一个自发的吸热熵驱动的扩散控制过程。该方法显著提高了组胺的回收率，牛奶中组胺的检测限（LOD）为0.14 mg/L，定量限（LOQ）为0.47 mg/L。日内和日间精密度分别达到0.96%-1.46%和0.85%-1.71%。这种集成方法操作简便、成本低廉、环保，并显著提高了传统检测方法的灵敏度、准确性和可靠性，为复杂乳制品基质中微量组胺的快速高效检测提供了可靠的技术方案。

引言

组胺（His）是一种生物胺，由L-组氨酸在L-组氨酸脱羧酶的催化下通过酶促脱羧反应生成[1]。它是富含蛋白质食品变质的主要产物[2]。过量摄入含有高浓度组胺的食品会增加人体内的组胺负担并引发组胺毒性[3][4]。敏感人群即使摄入少量组胺（如5 mg）也可能出现不适症状[5]。国际标准规定牛奶中的组胺含量不得超过50 mg/kg[6]。在整个生产和加工过程中必须监测生物胺的总量，并符合风险评估要求[6][7]。常用的组胺检测方法包括高效液相色谱（HPLC）[8]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[9][10]、气相色谱-质谱（GC-MS）[11]、荧光光谱[12]、电泳[13]和光谱法[14][15]。其中，光谱法通过测量组胺与显色试剂（如偶氮试剂或邻苯二甲醛）反应生成的有色化合物的吸光度来定量组胺[16]。该方法因操作简便、检测快速且对仪器要求不高而常用于快速筛查[17]。然而，其相对较低的灵敏度仍是一个显著缺点。因此，亟需开发快速、简单且高灵敏度的组胺检测方法。

液相微萃取（LPME）是一种新型绿色萃取技术，利用微量萃取溶剂实现目标分析物的有效分离和富集[18][19]。基于固化浮选有机滴液（SFOD）的改进方法使用低毒性的长链脂肪醇（如十一醇、十二醇、十四醇、十六醇）作为萃取剂，有效替代了传统的卤代烃萃取剂[20][21][22]。与卤代烃相比，长链脂肪醇毒性更低、更易于操作、微生物降解性更强、对环境影响更小[23][24]。这些醇的熔点较低，可在冰浴中迅速固化[25]，其密度低于水相，固化后可直接进行物理转移[26]。此外，可以通过分散剂或物理辅助方法解决长链脂肪醇分散性差的问题[20]。其中，超声波-微波（UM）分散技术是分散长链脂肪醇的理想方法[20][24]。该技术结合了超声波的空化效应和微波的热效应（介电加热），实现颗粒或液滴的有效分散、乳化和破乳[24][27][28]。

本研究提出了一种简单高效的牛奶中组胺富集和检测方法。首先使用变性剂去除蛋白质干扰，然后将组胺衍生为His-azo化合物，再通过超声波-微波辅助的固化浮选有机滴液相微萃取（UMA-SFOD-LPME）进行富集。萃取剂在低温下固化，通过离心分离后重新溶解，最后通过紫外-可见（UV-Vis）光谱法进行定量。通过单因素实验系统优化了萃取条件，以组胺的回收率为评价指标。优化的主要参数包括变性剂的类型、萃取剂的类型和体积、超声辅助萃取条件（功率、时间和温度）以及离心条件（速度、时间和温度）。同时监测了动态萃取过程，以深入了解其萃取机制。这一综合策略为复杂乳制品基质中组胺的准确测定提供了新的方法框架。

材料

组胺磷酸盐购自源叶生物科技有限公司（上海，中国）。癸醇、1-十二醇、1-十四醇、1-十六醇、盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）、醋酸锌（Zn(CH₃COO)₂、盐酸胍（NHC(NH₂)₂·HCl）、十二烷基硫酸钠（SDS）、碳酸钠（Na₂CO₃）、对硝基苯胺、亚硝酸钠（NaNO₂）、乙醇和Triton X-100均购自Macklin生化有限公司。

蛋白质变性剂

为测定牛奶中的组胺含量，必须通过变性去除蛋白质以消除基质干扰。评估了多种变性剂（包括强酸、碱、盐和有机溶剂）作为沉淀剂的可能性（详见表1）。每种变性剂均使用适量以确保蛋白质完全沉淀。其中，HCl、NaOH、(NH₄)₂SO₄、Zn(CH₃COO)₂和乙醇能有效分离蛋白质和溶剂。

结论

本研究开发了一种高效的牛奶中组胺含量检测方法。组胺-azo化合物通过UMA-SFOD-LPME过程被提取和富集，随后通过低温离心固化并分离萃取剂。最终利用UV-Vis光谱仪测定组胺含量。通过单因素实验系统优化了关键参数，包括变性剂的类型、萃取剂的类型和体积等。

CRediT作者贡献声明

刘振民：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理。田波：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。刘思远：软件开发、方法学设计。李建平：数据可视化与验证。张怀杰：实验设计、数据分析。谢志新：初稿撰写、方法学设计、概念构思。庞明尧：方法学设计、数据管理

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

资助

本研究得到了国家乳品生物技术重点实验室开放项目计划（项目编号：SKLDB2023-004）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。