脊髓性肌萎缩症模型中广泛的内含子滞留和外显子跳跃揭示选择性剪接改变的保守机制

《Human Molecular Genetics》：Widespread intron retention and exon skipping characterise alternative splicing changes in a C. elegans model of spinal muscular atrophy

本研究针对脊髓性肌萎缩症（SMA）中SMN蛋白缺失导致RNA剪接紊乱的机制难题，利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）模型开展全转录组分析，发现smn-1缺失引发超过1000个选择性剪接事件，其中内含子滞留和外显子跳跃最为显著。研究通过序列 motif 分析揭示剪接位点由强向弱转换的规律，并首次发现smn-1依赖的剪接事件与U6 snRNA m6A甲基化调控存在重叠。该成果发表于《Human Molecular Genetics》，为理解SMA病理机制和开发广谱剪接校正疗法提供新视角。

　　

在遗传性神经系统疾病中，脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）如同一道难解的谜题。患者由于生存运动神经元（Survival Motor Neuron, SMN）蛋白的缺失，逐渐丧失运动能力，甚至面临生命威胁。SMN蛋白是细胞中RNA剪接机器的关键组成部分，负责确保基因信息从DNA到蛋白质的精确传递。当SMN蛋白水平下降时，细胞的剪接过程会出现混乱，导致基因表达异常。然而，科学家们一直困惑的是：究竟哪些具体的剪接错误直接导致了疾病的发生？这些错误是否有规律可循？

为了解开这个谜团，研究人员将目光投向了微观世界中的一位“老熟人”——秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。这种微小的透明蠕虫虽然结构简单，却拥有与人类相似的基因和细胞过程。更重要的是，线虫的smn-1基因与人类的SMN1基因同源，当smn-1缺失时，线虫也会出现发育迟缓、运动功能障碍等类似SMA的症状。这使得线虫成为研究SMA机制的理想模型。

在这项发表于《Human Molecular Genetics》的研究中，科学家们设计了一个巧妙的实验：他们利用smn-1(ok355)突变型线虫，这些线虫自身无法产生SMN-1蛋白，但依靠母体残留的SMN-1蛋白得以存活至幼虫阶段。通过将这类突变体与遗传背景相同的野生型线虫进行对比，研究人员能够在症状出现的关键时期，捕捉到SMN-1蛋白缺失对基因剪接的直接影响。

研究团队采用了多项关键技术方法：通过poly(A)+RNA测序技术对线虫幼虫进行全转录组分析；使用自定义转录组组装方法识别新的剪接异构体；采用SUPPA2软件进行选择性剪接事件定量分析；通过序列motif分析揭示剪接位点特征；并与mett-10（U6 snRNA m⁶A甲基转移酶）和snrp-27（剪接体组分）突变体的剪接数据进行比较，以探索机制关联。所有测序数据已存入ArrayExpress数据库（登录号E-MTAB-16084）。

Zygotic loss of smn-1 leads to large-scale gene expression and splicing changes

研究发现，smn-1(ok355)突变体出现了大规模的基因表达紊乱：4579个基因表达上调，3059个基因下调。更引人注目的是，研究人员识别出1023个存在选择性剪接异常的基因，其中外显子跳跃和内含子滞留事件不仅数量最多，且剪接指数变化（ΔPSI）最为显著。这些剪接错误中，约197个基因同时存在表达水平和剪接模式的改变，但两者之间并无明显相关性。值得注意的是，大多数内含子滞留会导致阅读框移位，而外显子跳跃往往保持阅读框不变，这暗示了不同的分子后果。

Functional and tissue enrichment analyses of smn-1 targets

对剪接异常基因的功能分析揭示了它们与幼虫发育过程的紧密联系：这些基因富集于黏着连接组织、肌动蛋白骨架调控、肌肉系统形态发生等关键生物学过程。表型分析显示，这些基因的异常与体细胞转基因沉默、RNAi抗性、P颗粒异常、不育等表型相关。组织特异性分析表明，神经元（特别是PVD神经元）、生殖系统（如受精囊）及表皮细胞是smn-1缺失的主要受影响部位，这解释了线虫模型中观察到的发育停滞和生殖缺陷现象。

Alternative 5' splice site usage in smn-1(ok355) animals

深入分析5'剪接位点的使用模式后，研究人员发现了一个有趣的现象：在smn-1缺失的线虫中，剪接体倾向于使用较弱的5'剪接位点。典型的5'剪接位点序列为AG//GURAG（R代表A或G），而突变体中活跃的位点往往在-3、-4位置缺少A/G碱基，在+4、+5位置缺少A/G碱基，导致整体剪接强度下降。例如，神经肽基因nlp-16的内含子3在正常情况下会均衡使用两个5'剪接位点，但在smn-1突变体中，其中一个位点的使用率下降了15%。

Alternative 3' splice site usage in smn-1(ok355) animals

3'剪接位点的变化同样显著，占所有剪接事件的19.1%。与5'剪接位点类似，smn-1缺失导致3'剪接位点使用从较弱的上游位置向较强的下游位置转移，但整体上强弱转换的趋势相对平衡。典型3'剪接位点序列UUUCAG/R在突变体中发生变化，特别是-3位置的C碱基频率降低。例如，clh-1基因内含子11的两个剪接位点中，上游位点的使用率从野生型的40%降至突变体的20%。

Intron retention and exon-skipping in smn-1(ok355) animals

内含子滞留和外显子跳跃是smn-1缺失中最突出的剪接异常。滞留的内含子通常具有非典型的剪接位点序列，如cyp-31A1基因的内含子5含有AG//GUAAC（5'SS）和CUACAG//G（3'SS）的非典型序列，其在突变体中的滞留水平显著升高。外显子跳跃事件则与两端较弱的剪接位点相关，但序列特征本身并不能完全预测跳跃方向。例如，水通道蛋白基因aqp-2的内含子5在突变体中跳跃增加，而二氢嘧啶脱氢酶基因W07E11.1的内含子10跳跃反而减少。

Overlap of smn-1 dependent splicing changes with other splicing factors

为探究SMN-1影响剪接的机制，研究人员比较了smn-1缺失与mett-10（U6 snRNA m⁶A甲基化酶缺失）和snrp-27（剪接体组分突变）引起的剪接变化。结果显示，smn-1与mett-10敏感的剪接位点存在显著重叠，特别是在3'剪接位点变化方向上高度一致；然而，smn-1与snrp-27的剪接变化重叠度很低。这表明SMN-1可能通过影响U6 snRNA的m⁶A修饰参与剪接调控，而非直接介入剪接位点识别。

这项研究系统揭示了SMN-1缺失导致的全局性剪接紊乱特征：内含子滞留和外显子跳跃是最主要的异常类型；剪接位点使用呈现由强向弱转换的趋势；剪接变化与U6 snRNA m⁶A修饰调控存在机制关联。这些发现不仅证实了SMN在维持剪接保真度中的核心作用，还揭示了剪接错误并非随机发生，而是遵循特定的序列规律。更重要的是，该研究为SMA的治疗策略提供了新思路：针对剪接效率的广谱性提升可能比纠正单个基因缺陷更具治疗潜力。由于剪接机制在进化上高度保守，这些在线虫模型中的发现在人类SMA中很可能同样适用，为理解疾病机制和开发新型疗法奠定了重要基础。