基于基因组的重新评估揭示了在原核生物物种鉴定中固定dDDH阈值的方法存在的局限性

《Current Research in Microbial Sciences》：Genome-based reassessment of Sphingobacterium reveals the limitation of fixed dDDH threshold in prokaryotic species delineation

基因组比较和系统发育分析揭示Sphingobacterium属存在非传递性dDDH矛盾，需整合多指标界定物种边界，合并S. detergens与S. ginsenosidimutans，并重新分类R. faecis为S. faecis。

　　
该研究聚焦于鞘氨单胞菌属（*Sphingobacterium*）的物种分类修订，通过整合基因组学、系统发育学、泛基因组学及功能基因组学等多维度证据，揭示了传统基于固定阈值的分类方法（如dDDH）在复杂基因组结构下的局限性，并提出新的分类框架。以下为关键发现解读：

### 一、研究背景与核心问题
鞘氨单胞菌属作为拟杆菌门（Bacteroidota）的重要类群，广泛分布于土壤、水体及生物膜等环境中。其基因组特征表现为高度开放泛基因组结构，即核心基因数量极低（仅22个），而可变云基因占比高达97.8%（约19,000个）。这种基因组特性导致传统分类指标（如dDDH阈值70%）在界定物种边界时存在显著偏差，具体表现为：
1. **非传递性基因组相似性悖论**：在*W. siyangense*亚群中，A与B、B与C的dDDH均≥70%，但A与C的dDDH却<70%，形成矛盾关系。
2. **高基因组相似性下的分类冲突**：部分近缘物种的ani值接近或超过95%阈值，但功能分化程度较低，导致分类标准失效。

### 二、方法论创新
研究采用多层级组学整合策略：
1. **全基因组比较（WGC）**：分析264个属内近缘物种的全基因组，结合24个*W. siyangense*非模式菌株，构建包含60个*Sphingobacterium*模式株的基因组数据库。
2. **多指标交叉验证**：
- **核心基因组SNP分析**：通过43,000-135,000个核心SNP检测，发现系统发育树与dDDH指标存在显著分歧。
- **氨基酸序列一致性（AAI）**：发现AAI>95%的强关联性（与ani值高度一致），但dDDH仅部分吻合。
- **功能基因聚类**：通过KEGG注释发现，即使dDDH值低于阈值，菌株间仍共享92%的CAZyme酶家族和88%的次级代谢合成基因簇（BGCs）。

3. **泛基因组动态建模**：
- ** genus级泛基因组**：发现197,255个基因，其中云基因占比98.7%，核心基因仅22个，显示高度基因组可塑性。
- ** species级泛基因组**：*W. siyangense*亚群形成"核心-软核心-壳层-云基因"四级结构，云基因中仅3.2%存在功能注释差异。

### 三、关键发现与分类修订
1. **物种边界重构**：
- **合并*W. siyangense*亚群**：基于ani>95%、AAI>95%、核心基因组SNP一致性>99.7%三项指标，将原分类中的3个亚种（*sps. siyangense*, *sps. cladoniae*及未正式发表的*W. paramultivorum*）合并为单一物种*W. siyangense*。
- **更名处理**：
*W. ginsenosidimutans*被确立为*d. detergens*的异名（命名权更替），因其基因组与后者ani值达96.5%、AAI值97.0%，且存在明确的水平基因转移证据。
*R. faecis*重新归类为*S. faecis*（新组合名），其16S rRNA序列与*S. siyangense*的进化距离（核心SNP差异率<0.5%）和代谢特征（携带6个独特的BGCs）均符合属内近缘标准。

2. **技术局限突破**：
- **非传递性矛盾解析**：通过泛基因组分析发现，dDDH差异源于云基因（如次级代谢相关基因）的非随机分布。在*W. siyangense*亚群中，这类基因在特定生态位菌株间呈现偏好性重组。
- **AAI指标优势性**：在检测到dDDH<70%的基因对（如O113_G2与w15_T）中，AAI仍保持>95%，证明翻译后修饰基因（如COG功能域编码基因）比DNA序列更能反映进化关系。

### 四、功能基因组学证据
1. **代谢核心一致性**：
- 所有菌株均携带脂多糖合成（lps）、ABC转运蛋白（ABC）及多聚酮合酶（PKS）核心通路。
- 次级代谢差异集中在特定BGCs：*W. siyangense*携带12个典型鞘氨醇单胞菌BGCs（如植物激素合成簇、聚酮合成簇），而*d. detergens*（现归入*S. detergens*）特有3个新型BGCs，与宿主植物（人参、大豆）的共生关系相关。

2. **环境适应性分化**：
- 产类胡萝卜素菌株（如CGMCC 1.6855_T）与塑料降解菌株（如PDNC006）的云基因共享度达78%，但核心功能基因（如硝酸盐还原酶）无显著差异。
- 粪便来源的*S. faecis*与土壤菌株相比，在肠道微生物特有的脂质修饰酶（如MGLP）和抗生素抗性基因（如sul1）上存在显著富集。

### 五、分类学体系重构
研究提出"四维分类框架"：
1. **核心基因组（Core Genome）**：22个管家基因构成物种级生物学标识物，包括细胞膜相关基因（如脂多糖合成基因lpxL）、能量代谢基因（如menA编码MK-7合成酶）。
2. **软核心基因组（Soft Core）**：6个高保守基因（如ABC转运蛋白atpB），在所有模式菌株中含量≥95%。
3. **功能云基因（Functional Cloud）**：包含234个功能注释基因（如脂多糖合成基因lpxA、多糖聚合酶gapA），其分布与菌株生态环境（土壤/粪便/塑料）呈现显著相关性（p<0.01）。
4. **结构云基因（Structural Cloud）**：196,469个非功能注释基因，其中87%属于重复序列或转座子元件。

### 六、理论意义与实践价值
1. **方法论革新**：
- 首次建立AAI>95%的物种阈值标准，其检测窗口比ani值更宽（涵盖-6到+5% GC含量差异）。
- 开发"三指标交叉验证"算法：要求同时满足ani≥95%、AAI≥95%、dDDH≥60%三项指标方可确认物种。

2. **生态机制启示**：
- 泛基因组开放性（云基因占比98.7%）与菌株环境适应性高度相关，证明动态基因组是微生物适应多变微生态的核心机制。
- 发现dDDH值与菌株环境暴露度呈负相关（r=-0.63，p=0.008），暗示开放式分类系统可能更适用于环境微生物研究。

3. **分类实践指导**：
- 建立属级"核心基因-功能模块"双轨命名体系，如*S. faecis*以faecis（粪便）为核心环境标记，辅以携带sulfR硫转移抗性基因的模块化特征。
- 提出三级分类建议：属（Genus）-功能群（Functional Cluster）-环境亚群（Environmental Subgroup），实现分类单元与生态位精准对应。

### 七、研究局限性及未来方向
1. **数据局限性**：
- 现有模式菌株覆盖度不足（仅占全球分离株的6.2%）。
- 功能注释数据库（如KEGG）对次级代谢基因的覆盖率仅为68%。

2. **技术优化方向**：
- 开发基于蛋白质组学的动态分类模型，整合翻译后修饰数据（如磷酸化位点预测）。
- 构建环境特异性基因组特征库，实现从"物种"到"生境适应性单元"的连续体分类。

3. **理论深化需求**：
- 探索基因组可塑性阈值与物种形成机制的定量关系。
- 建立基于生态位重叠度（Ecological Overlap Index, EOI）的分类辅助标准。

该研究通过多组学整合方法，不仅解决了传统分类学在开放泛基因组类群中的难题，更揭示了环境微生物分类的深层逻辑：物种应定义为具有高度功能保守性的基因组模块集合，而非单纯基于基因相似性的机械划分。这种分类范式为后续微生物资源开发（如生物降解剂生产菌株筛选）提供了新的技术路径，预计将推动环境微生物学领域在物种定义标准、生态适应性分析等方向的研究范式转变。