纳米孔中的适配体构象传感技术用于原位定量检测纳摩尔浓度下的镉离子

《Analytica Chimica Acta》：Aptamer Conformation Sensing in Nanopore for On-Site Quantitative Detection of Cadmium Ions at Nanomolar Concentrations

本研究开发了一种基于纳米孔的aptamer构象传感策略，用于定量检测镉离子。通过监测DNA aptamer在M2-MspA纳米孔中的构象变化，结合分子动力学模拟和电信号分析，实现了镉离子在纳摩尔级别的高灵敏度检测，并成功应用于实际水样分析，展现出环境监测的潜力。

　　

何书军|刘荣辉|包欣欣|庞佳媛|张曦|刘月|林文福|刘家墩|李天欣|李尧|李毅|郭新荣

广东医科大学附属第一医院，中国东莞523808

摘要

背景

传统上，重金属离子的检测依赖于基于实验室的光谱技术，这些技术通常耗时、复杂，且不适合实时监测。为了解决这一挑战，我们引入了一种适配体构象传感策略，并评估了其检测镉离子的能力。该传感策略通过监测单个DNA适配体在与镉离子结合前后在纳米孔中的对接变化来定性推断镉离子（Cd²⁺）的存在，并通过提取特征事件的数量来定量确定其浓度。

结果

分子动力学模拟显示，镉离子（Cd²⁺）的结合会诱导结构重排，使适配体的穿透深度从5.20纳米（游离DNA）降低到1.66纳米（DNA_Cd²⁺）。电信号表明，未结合的适配体会产生持续的电流阻断（ΔI/I₀ = 42%），而镉离子复合物则产生瞬态信号（ΔI/I₀ = 25%）。双参数分析（ΔI/I₀ vs. I_rms）实现了精确检测。该传感器的检测限为33.8纳摩尔，并且对Mn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺和Fe³⁺的选择性超过93倍。现场验证显示，检测结果与ICP-MS的结果一致。意义：这些发现突显了基于纳米孔的适配体构象传感作为在复杂环境基质中实时定量检测重金属离子的强大平台的潜力。

引言

在环境监测、食品安全和临床诊断等多个领域，对小分子（尤其是重金属离子）的即时检测至关重要[1]、[2]。虽然原子吸收光谱（AAS）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等传统方法非常有效，但需要昂贵的设备[3]、[4]、[5]、[6]以及专业技术人员，并且需要集中式的实验室，这限制了它们在野外应用中的可行性[2]、[7]。纳米孔传感技术的最新进展为这一领域提供了有前景的替代方案[8]、[9]。该方法通过测量离子或分子通过纳米孔时的电流波动来实现对低浓度分析物的检测，从而达到了前所未有的灵敏度[9]、[10]、[11]。

基于纳米孔的传感器，如α-溶血素和MspA，在选择性检测金属离子方面显示出巨大潜力[12]、[13]、[14]。例如，经过组氨酸残基修饰的α-HL可以选择性地检测Zn²⁺[15]，而M2-MspA-H变体可以区分多种金属离子，包括Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Pb²⁺[16]。最近的创新通过将合成配体（如Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸+水合物（ANTA）整合到M2-MspA纳米孔中，进一步提高了纳米孔的灵敏度，从而能够选择性地捕获和识别稀土元素[17]。尽管取得了这些进展，但重金属离子的定量检测仍然具有挑战性。识别元件常常表现出交叉反应性，需要高浓度才能产生可区分的信号，而复杂的样品基质会引入干扰，影响重复性和准确性。

适配体提供了一个有吸引力的解决方案。这些短的单链核酸与抗体相比，具有更高的结合亲和力、结构适应性和更好的稳定性[18]、[19]、[20]、[21]。重要的是，目标结合会诱导明显的构象变化，这些变化可以通过纳米孔读数捕获，从而实现选择性和定量检测[22]、[23]、[24]。最近的研究表明，纳米孔可以解析适配体在目标结合时的构象动态[25]、[26]，并且可以检测金属配位时的电荷变化[14]，这突显了它们在定量生物传感方面的潜力。然而，这样的策略是否可以扩展到在复杂环境基质中选择性和定量检测有毒重金属离子（特别是Cd²⁺），目前尚无定论。

在这项研究中，我们开发了一种基于纳米孔的传感策略，利用工程化的M2-MspA纳米孔中的DNA适配体构象变化来定量检测Cd²⁺。通过离子电流测量来监测适配体在结合镉离子时的结构变化，并通过分子动力学模拟进一步了解了适配体-纳米孔的相互作用。系统评估了竞争金属离子的影响，并建立了定量检测模型。该方法能够在纳摩尔水平上实现灵敏的镉离子检测，并成功应用于实际水样，展示了其在实际环境分析中的潜力。

材料与试剂

本研究中使用的DNA适配体及其编码M2-MspA变体序列由青科生物技术有限公司（北京，中国）合成。随机DNA来自DL1000 DNA Marker（Takara Bio, Inc., 日本）。CdCl₂、NiCl₂和HCl购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（上海，中国），而CaCl₂、FeCl₃、MnCl₂、CuCl₂、CoCl₂和NiCl₂则购自Macklin, Meryer和Energy Chemical Co., Ltd。所有DNA和化学品均溶解在

适配体-纳米孔混合传感器的设计与原理

本研究中镉离子（Cd²⁺）的检测原理如图1所示。选择了一种25个核苷酸（nt）长的DNA适配体（5’-GAC GAC GGG TTC ACA GTC CGT TGTC-3’），该适配体先前已被报道具有高亲和力和特异性，能够结合镉离子[39]、[40]。在没有镉离子的情况下，这种适配体会自然折叠成高度为4.34纳米、宽度为1.96纳米的稳定发夹结构（PDB ID: 8GZJ）（图1a）。当镉离子结合时（图1b），通过G9、C12等碱基发生配位

讨论

本研究表明，在M2-MspA纳米孔中对特定DNA的构象传感是一种有效的镉离子定量检测策略[48]、[49]。在1M NaCl和+100 mV的条件下，能够最佳地区分结合了镉离子的适配体和未结合的适配体，从而确保了高结合效率和信号稳定性。在没有镉离子的情况下，适配体会产生持久的电流阻断，而镉离子的结合则会导致较短、较浅的电流变化，表明

CRediT作者贡献声明

李毅：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、数据管理。李尧：撰写 – 审稿与编辑、软件开发、项目管理。刘荣辉：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、实验研究、数据管理。郭新荣：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、数据管理。何书军：验证、实验研究、数据管理。李天欣：

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可应相应作者的要求提供。

利益冲突

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号32371526,82404318, 62171211, 32100021和12275137）；广东省基础与应用基础研究基金（2022A1515140191）；深圳市科技创新委员会（JCYJ20220814170440001, JCYJ20220818100218039, JCYJ20220530113013030, 和 JCYJ20230807092459028）；以及广东省医学科学技术研究基金（A2024159）和广东医科大学青年研究项目的支持。