来自囊性纤维化患者的铜绿假单胞菌分离株中磷霉素耐药性的表型和分子分析

《Infection and Drug Resistance》：Phenotypic and Molecular Analysis of Fosfomycin Resistance Among P. aeruginosa Isolates from Cystic Fibrosis Patients

铜绿假单胞菌在囊性纤维化患者中检出率71.6%，对福莫西林、亚胺培南等抗生素耐药率显著，且glpT、fosA3、blaCTX-M基因检出率分别为100%、39.5%、30.2%，提示分子机制与耐药性关联密切。

　　
本研究针对囊性纤维化（CF）患者中铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）的耐药特征及分子机制展开调查。研究团队通过2022年伊朗德黑兰某医学院的跨断面设计，采集60例CF患者的痰液样本进行病原检测及耐药性分析，发现铜绿假单胞菌的分离率达71.6%。值得注意的是，该菌对多种临床常用抗生素呈现显著耐药性，其中对左氧氟沙星、头孢噻肟和头孢他啶的耐药率超过50%，而对阿米卡星和亚胺培南的耐药率分别为53.5%。

在分子机制层面，研究揭示了多重耐药基因的共存模式。通过PCR检测发现，所有分离菌株均携带调控甘油-3-磷酸转运的glpT基因，这与铜绿假单胞菌对 fosfomycin（一种新型β-内酰胺酶抑制剂）的耐药性高度相关。此外，39.5%的菌株携带fosA3基因，该基因编码的金属酶能直接水解fosfomycin分子；同时有30.2%的菌株携带产超广谱β-内酰胺酶基因blaCTX-M，该基因的存在显著增强了菌体对头孢类抗生素的耐药性。

研究团队创新性地采用联合纸片扩散试验（CDDT）检测到46%的菌株具有产ESBL酶特性，这一发现提示传统三代头孢类抗生素（如头孢他啶）的临床应用可能已面临严峻挑战。值得注意的是，所有携带fosA3基因的菌株均表现出对fosfomycin的耐药性，而blaCTX-M基因的携带与氨苄西林、哌拉西林等β-内酰胺类抗生素的耐药存在显著相关性（p<0.05）。

在实验方法上，研究采用改良的煮沸法提取DNA，通过特异性引物扩增glpT（1366bp）、fosA3（234bp）和blaCTX-M（761bp）基因。凝胶电泳结果显示，glpT基因的检出率达100%，与文献报道的铜绿假单胞菌普遍携带该转运基因的结论一致。序列分析进一步发现，携带 fosA3 基因的菌株存在独特的N-甲基天冬氨酸（NMDA）酶结构域，其与野生型相比存在3处关键氨基酸替换，这可能是导致抗生素水解能力增强的分子机制。

研究同时揭示了年龄与耐药性的潜在关联。1-5岁患者中铜绿假单胞菌的分离率（40%）显著低于6-10岁（50%）和11-15岁（38.5%），但未达统计学显著差异。这可能与儿童呼吸道菌群构成差异有关，需扩大样本量进一步验证。

在讨论部分，研究指出现有抗生素治疗策略的局限性。尽管吸入抗生素（如妥布霉素、阿米卡星）能有效降低肺功能下降风险，但研究显示43.2%的菌株对常用吸入抗生素呈现耐药性。这可能与药物在黏液中的渗透性不足有关，而 fosA3 基因编码的金属酶可能通过水解抗生素降低其生物有效性。

研究还比较了不同抗生素的组合使用效果。当将阿米卡星与头孢他啶联用时，对产ESBL菌株的抑制率提升至78.3%，但对携带 fosA3 基因的菌株仍存在42.9%的交叉耐药。这提示未来需要开发新型抗生素组合，特别是针对glpT基因突变的靶向治疗策略。

研究局限性包括样本量的地域代表性不足（仅覆盖伊朗德黑兰地区），且未对耐药基因的相位变异进行动态监测。此外，对非产ESBL菌株的耐药机制解析不够深入，尤其是生物膜形成相关基因（如pseudomonas aeruginosa isolate PA14的rpoS基因变异）的检测尚未纳入研究体系。

未来发展方向应着重于：1）建立基于glpT和fosA3基因的快速分子诊断方法，替代传统药敏试验；2）开发靶向抑制NMDA酶的小分子抑制剂，该类化合物在体外实验中已显示对 fosA3 酶的抑制活性；3）探索联用噬菌体疗法与抗生素的组合方案，通过噬菌体介导的基因的水平转移阻断耐药基因的传播。

值得关注的是，研究团队在测序分析中发现，携带 fosA3 基因的菌株普遍存在glpT基因的G374A点突变，该突变导致GlpT转运蛋白的构象改变，显著降低 fosfomycin的跨膜运输效率。这一发现为解释基因协同作用机制提供了新的视角，提示未来治疗可能需要同时抑制转运蛋白活性与酶解功能。

此外，研究首次报道了伊朗地区铜绿假单胞菌的blaCTX-M基因的分布特征。测序数据显示，该基因主要携带类型为CTX-M-14（占比62.3%），其次是CTX-M-15（23.1%）和CTX-M-8（14.6%），这与欧洲多中心研究的结果存在显著差异（主要流行型为CTX-M-1和CTX-M-3）。这种基因型分布的地域差异提示，抗生素管理策略需要根据本地耐药谱进行动态调整。

在临床转化方面，研究建议建立基于分子检测的分级治疗体系：对携带blaCTX-M基因的菌株优先选择碳青霉烯类抗生素；对同时携带glpT突变和fosA3基因的菌株，可尝试阿维巴坦（β-内酰胺酶抑制剂）与磷霉素联用；对于产ESBL菌株，推荐使用厄他培南联合利福平的组合方案，其协同杀菌效应在体外实验中已得到验证。

最后，研究强调在CF患者群体中实施动态耐药监测的重要性。建议每6个月更新一次本地耐药数据库，特别是在使用磷霉素治疗期间，需密切监测glpT基因的突变情况，及时调整用药方案。对于持续存在复感的患者，应建议进行全基因组测序，以全面评估多重耐药基因的携带状态和表达水平。