GM-CSF与特定2型细胞因子诱导cDC1和cDC2中CD103+与CD301b+细胞状态的功能分化

《Cell Reports》：GM-CSF and specific type 2 cytokines induce CD103+ and CD301b+ cell states in cDC1s and cDC2s

本研究针对传统树突状细胞（cDC）异质性中CD301b+ cDC2的起源争议，通过建立体外培养体系证实GM-CSF与FLT3L协同驱动CD103+ cDC1与CD301b+ cDC2分化。研究发现CD301b标记的是细胞因子诱导的状态而非独立谱系，且肺脏DC特异性依赖GM-CSF信号通路，而IL-3/IL-4/IL-13可替代其功能。该成果发表于《Cell Reports》，为组织特异性免疫调控提供了新视角。

　　

在免疫系统中，传统树突状细胞（conventional dendritic cells, cDCs）是适应性免疫应答的关键调控者。根据发育起源、表型和功能，cDCs被分为cDC1和cDC2两个主要亚群。cDC1擅长交叉呈递抗原并激活CD8⁺ T细胞，而cDC2则更擅长激活CD4⁺ T细胞，尤其是Th2和Th17应答。尽管cDC的异质性已得到广泛认可，但cDC2内部的复杂性仍存在许多未解之谜。其中，表达CD301b（一种C型凝集素受体）的cDC2亚群在屏障组织（如皮肤、肺脏）中富集，并在Th2/Th17免疫中发挥重要作用，然而其发育起源和调控机制长期存在争议：它究竟是一个独立的细胞谱系，还是由细胞因子诱导的临时状态？

为解决这一问题，由Lukas Amon、Diana Dudziak等领导的研究团队在《Cell Reports》上发表了最新研究。他们通过建立一种新型的体外培养系统，结合基因工程小鼠模型，深入揭示了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和特定2型细胞因子（如IL-3、IL-4、IL-13）在诱导cDC1和cDC2功能分化中的核心作用。研究发现，CD301b并不标记一个独立的cDC2谱系，而是代表了由GM-CSF等细胞因子诱导的细胞状态，这一状态可来源于不同的前体细胞（包括DC2和DC3前体）。更重要的是，肺脏中的cDCs独特地依赖细胞自身对GM-CSF的感知来获得CD103（cDC1）和CD301b（cDC2）表型，而其他组织中的cDCs则可能通过IL-3、IL-4、IL-13等细胞因子补偿GM-CSF信号的缺失。这项研究不仅澄清了CD301b⁺ cDC2的起源问题，还强调了细胞因子微环境在塑造组织特异性DC功能中的重要性，为理解免疫应答的精细调控提供了新的理论基础。

研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们建立了基于骨髓细胞的体外培养系统，通过时序性添加FLT3L和GM-CSF来模拟cDC的发育过程。利用流式细胞术进行高维表型分析、细胞分选以及细胞内细胞因子检测，评估了不同DC亚群的表型、功能和发育潜能。通过使用条件性基因敲除小鼠（如CD11c^CRE×CSF2Rα^fl/fl小鼠）和细胞因子缺陷小鼠（如GM-CSF^-/-小鼠），在体内验证了GM-CSF信号通路对DC分化的必要性。此外，还采用了DC与T细胞共培养实验来评估抗原呈递和T细胞活化能力，并通过细胞因子 bead 阵列（CBA）量化DC产生的细胞因子和趋化因子。研究中所用的细胞样本主要来自C57BL/6J小鼠的多种组织（如骨髓、脾脏、肺脏、淋巴结、胸腺和肝脏）。

GM-CSF驱动表型独特的CD301b⁺ cDC2和CD103⁺ cDC1的生成

为了模拟体内cDC的异质性，研究人员首先建立了一种体外培养方案。他们在骨髓细胞培养中先使用FLT3L促进DC祖细胞发育，然后在第4天加入GM-CSF，并在第6天进行分析。结果显示，GM-CSF的加入是生成CD301b⁺ cDC2和CD103⁺ cDC1的必要条件。通过高维流式细胞术分析，证实这些体外生成的细胞表达经典的cDC标志物（如Zbtb46、CD26、MHC-II），而不表达巨噬细胞标志物（如MafB、MerTK），表明它们是真正的cDC，而非其他髓系细胞。主成分分析（PCA）进一步表明，GM-CSF主要是在cDC1和cDC2各自的身份特征基础上，进一步修饰其蛋白质组。

GM-CSF调控并增强cDC的功能特性

接下来，研究团队比较了GM-CSF存在与否下分化的cDC亚群的功能差异。在受到多种Toll样受体（TLR）配体刺激后，GM-CSF分化的cDC1和cDC2表现出独特的细胞因子/趋化因子分泌谱。例如，GM-CSF增强了CD103⁺ cDC1在Zymosan刺激后产生IL-12p40的能力，以及CD301b⁺ cDC2在ODN1826刺激后产生CCL5和CCL22的能力。更重要的是，在T细胞共培养实验中，无论是通过肽段直接加载抗原，还是通过可溶性卵清蛋白（sOVA）喂养让DC自行摄取抗原，GM-CSF分化的所有cDC亚群（包括cDC1和cDC2）均表现出更强的CD8⁺和CD4⁺ T细胞活化能力。这表明GM-CSF不仅改变了DC的细胞因子分泌模式，还普遍增强了其共刺激能力，从而提升了其免疫启动功能。

组织中的CD103^- cDC1和CD301b^- cDC2无法分化为CD103⁺ cDC1和CD301b⁺ cDC2

一个关键问题是，组织中已成熟的CD103^- cDC1和CD301b^- cDC2能否在GM-CSF刺激下转变为CD103⁺或CD301b⁺状态？研究人员发现，尽管所有组织cDC都表达GM-CSF受体α链（CSF2RA/CD116），但从脾脏等组织分离出的成熟cDC1和cDC2在体外暴露于GM-CSF后，均无法上调CD103或CD301b的表达。即使将这些成熟cDC与骨髓或脾脏的旁观者细胞共培养，也无法诱导其分化。相反，来自骨髓的更早期前体细胞则能响应GM-CSF。这表明，获得CD103或CD301b表型的能力是cDC发育早期的一个阶段性事件，一旦细胞成熟，这种可塑性就丧失了。

前体cDC（pre-cDC）可转变为CD103⁺ cDC1和CD301b⁺ cDC2

研究人员随后将目光投向cDC的发育早期阶段——前体cDC（pre-cDC）。他们发现，从骨髓中分离出的pre-cDC1和pre-cDC2在体外培养中，能够在GM-CSF的驱动下，分别高效地分化为CD103⁺ cDC1和CD301b⁺ cDC2。这表明pre-cDC1和pre-cDC2是GM-CSF依赖性CD103⁺ cDC1和CD301b⁺ cDC2的直接前体。

pro-DC3和pre-cDC2均可产生CD301b⁺ DC

近年研究发现，脾脏中的cDC2（XCR1^-CD172a⁺）包含两个发育路径不同的群体：FcγRIIB/III^-的DC2和FcγRIIB/III⁺的DC3。本研究发现，这两种群体中都存在CD301b⁺细胞。通过利用Clec9a^CRE×Rosa26^LSL-TdTomato小鼠进行谱系示踪，证实DC3及其前体（如Ly6C⁺ MDPs和pro-DC3）也属于Clec9a标记的cDC谱系，而非单核细胞来源。更重要的是，从骨髓中分离出的pro-DC3（相当于R2单核细胞）和pre-cDC2（相当于R3单核细胞）在体外培养中，都能在GM-CSF的诱导下产生CD301b⁺的细胞。这强有力地证明，CD301b⁺状态可以起源于不同的前体细胞（DC2和DC3谱系），进一步支持了CD301b是细胞因子诱导的状态而非独立谱系的观点。

GM-CSF信号感知是肺脏DC表达CD103和CD301b的特异性需求

为了验证GM-CSF在生理条件下的作用，研究人员分析了GM-CSF缺陷小鼠以及新构建的CD11c^CRE×CSF2Rα^fl/fl小鼠（DC特异性缺失GM-CSF受体）的组织cDC。结果显示，全身性GM-CSF缺失或DC本身无法感知GM-CSF信号，会显著影响肺脏中CD103⁺ cDC1和CD301b⁺ cDC2的比例和表型，但对其他组织（如脾脏、淋巴结、胸腺、肝脏）的影响较小或不存在。这表明肺脏cDC独特地依赖于细胞自身的GM-CSF信号来获得其功能性表型，而其他组织中可能存在补偿机制。

特定2型细胞因子可补偿GM-CSF诱导CD103和CD301b表达

鉴于其他组织cDC不完全依赖GM-CSF，研究人员探索了可能的替代因子。他们发现，IL-3（与GM-CSF共享受体β链CD131/CSF2Rβ）能够诱导cDC1表达CD103。而IL-3、IL-4和IL-13均能在体外诱导cDC2表达CD301b。这与分化中的cDC1仅表达IL-3受体，而cDC2表达IL-3、IL-4和IL-13受体的发现相一致。因此，在缺乏GM-CSF信号的情况下，这些2型细胞因子可以在特定组织中驱动CD301b⁺ cDC2的分化。

本研究通过建立的体外培养平台，成功生成了真正的CD103⁺ cDC1和CD301b⁺ cDC2，为研究其发育和功能提供了有力工具。研究明确地将CD301b⁺ cDC2定义为一种由细胞因子（主要是GM-CSF，以及IL-3、IL-4、IL-13）诱导的细胞状态，这种状态可跨越不同的发育谱系（DC2和DC3）。肺脏DC在获得CD103和CD301b表型上对GM-CSF信号的独特依赖性，凸显了组织微环境在塑造局部免疫细胞特性中的决定性作用。这些发现重新定义了我们对cDC异质性的理解，将关注点从固定的细胞谱系转向了细胞因子驱动的功能状态可塑性。这对于开发针对特定DC亚群的免疫疗法，尤其是在过敏、自身免疫和肿瘤免疫等领域，具有重要的指导意义。研究的局限性在于，对组织中DC2和DC3的鉴定主要基于FcγRIIB/III表达和表型比对，未来需要更精确的谱系追踪研究来最终确认其身份。