肾脏胰岛素样生长因子结合蛋白7通过调控STAT3乙酰化二聚体抑制线粒体能量代谢促进糖尿病肾病进展

《Nature Communications》：Renal insulin-like growth factor binding-protein 7 is a critical promoter of progressive diabetic kidney disease

本研究聚焦糖尿病肾病（DKD）进展新机制，揭示肾小管/足细胞源性胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）通过促进STAT3乙酰化二聚化，抑制AMPK/PGC-1α通路介导的线粒体脂肪酸氧化，导致脂质蓄积和肾纤维化。研究者通过转基因动物模型和高通量筛选，首次发现左旋亚叶酸（LA）可特异性拮抗IGFBP7-STAT3相互作用，为DKD治疗提供新靶点。

　　

糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD）是全球终末期肾病的主要病因，约40%的糖尿病患者会发展为DKD。其发病机制复杂，涉及免疫激活、炎症因子释放、趋化因子失调以及肾小管上皮细胞、足细胞和内皮细胞功能障碍等多种因素。近年来，空间转录组学分析揭示了肾脏中不同的细胞微环境（如肾小管、肾小球和免疫相关区域），强调了细胞特异性相互作用在DKD发病中的关键作用。尽管高血糖是DKD的主要驱动因素，但其导致肾间质纤维化和肾小球硬化的具体分子机制尚未完全阐明，尤其是肾小管上皮细胞能量代谢紊乱在其中的作用亟待深入探索。

先前临床研究表明，胰岛素样生长因子结合蛋白7（Insulin-like growth factor binding-protein 7, IGFBP7）在糖尿病早期阶段即升高，可作为疾病进展的预测指标。IGFBP7是一种普遍表达的29-kDa分泌蛋白，是衰老相关分泌表型的组成部分，具有多效性生物学效应，尤其通过调节G1/S细胞周期进程发挥作用。在肾脏病理中，尿IGFBP7与TIMP-2联合应用已证明对急性肾损伤风险分层具有预测价值。然而，IGFBP7在DKD中的具体病理生理角色及其调控肾脏微环境的机制尚不明确。

为此，发表于《Nature Communications》的这项研究，由安徽医科大学孟晓明教授团队领衔，系统揭示了肾小管和足细胞特异性表达的IGFBP7是促进DKD进展的关键因子。研究发现，IGFBP7通过与其相互作用蛋白STAT3结合，促进STAT3的乙酰化和二聚化，进而抑制AMPK信号通路及其下游过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达，最终导致线粒体生物能量学受损、脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation, FAO）障碍、脂质积累、细胞周期停滞、间质炎症和纤维化以及肾小球硬化。更为重要的是，研究者通过高通量药物筛选，发现左旋亚叶酸（Levomefolic acid, LA）是一种新型的IGFBP7小分子抑制剂，并在细胞和动物模型中验证了其通过靶向IGFBP7-STAT3轴缓解DKD进展的功效。

关键技术方法

本研究综合利用了多种关键技术：1）利用Igfbp7基因全身性敲除（KO）、肾小管特异性条件性敲除（cKO）和足细胞特异性条件性敲除（cKO^Nphs1）小鼠以及IGFBP7过表达转基因（Tg）小鼠，构建了链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病和高脂饮食（HFD）/STZ诱导的2型糖尿病DKD模型；2）采用染色质免疫共沉淀（ChIP）和dCas9-KRAB表观遗传编辑技术，阐明了组蛋白H3K4三甲基化（H3K4Me3）在调控IGFBP7转录上调中的作用；3）通过免疫共沉淀-质谱联用（Co-IP/MS）、表面等离子共振（SPR）和分子对接等技术，鉴定并验证了IGFBP7与STAT3的直接相互作用及其结构域；4）利用海马（Seahorse）能量代谢分析仪检测线粒体耗氧率（OCR），评估细胞能量代谢状态；5）通过计算机辅助药物虚拟筛选超过24,000种化合物，并结合细胞热位移分析（CETSA）和SPR验证，发现了IGFBP7的抑制剂LA。

研究结果

肾IGFBP7在糖尿病模型和DKD患者中表达上调

Western blot显示IGFBP7在成年小鼠多种器官中表达，其中肾脏表达较高。临床样本分析发现，与对照组相比，DKD患者肾活检组织中IGFBP7表达显著上调。相关性分析显示，血清IGFBP7水平与DKD进展和尿蛋白排泄（UPE）呈正相关，与估算肾小球滤过率（eGFR）呈负相关。在STZ诱导的1型糖尿病小鼠模型和HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型以及db/db遗传模型中，均观察到肾脏IGFBP7表达以及血清和尿液IGFBP7水平显著升高，且与蛋白尿程度正相关。体外实验表明，高糖（HG）条件可剂量和时间依赖性地上调小鼠肾小管上皮细胞（mTECs）、足细胞（MPC5）和系膜细胞（SV40）中IGFBP7的表达和分泌，其中肾小管上皮细胞反应最为显著。机制上，高糖通过上调组蛋白甲基转移酶MLL1/WDR5，增加IGFBP7启动子区域的H3K4Me3修饰，从而促进其转录。

肾脏IGFBP7促进小鼠模型DKD进展

在STZ诱导的1型DKD模型中，与野生型（WT）小鼠相比，IGFBP7 KO小鼠的蛋白尿、血清肌酐水平、肾小管扩张、间质纤维化、线粒体结构异常和肾小球硬化均显著减轻。在HFD/STZ诱导的2型DKD模型中，IGFBP7 KO同样显著改善了肾脏病理损伤。相反，在STZ诱导的糖尿病IGFBP7过表达转基因（Tg）小鼠中，肾脏损伤标志物（纤维化、炎症浸润、脂质积累等）加剧。这些功能获得和功能缺失实验共同证明了IGFBP7在DKD进展中的关键促进作用。

小管和足细胞中IGFBP7缺失抑制DKD进展

为了明确细胞特异性作用，研究者构建了肾小管上皮细胞特异性IGFBP7条件性敲除（cKO）小鼠。在STZ或HFD/STZ诱导的DKD模型中，cKO小鼠表现出显著减轻的蛋白尿、肾小管损伤、间质纤维化、炎症和脂质积累，线粒体损伤也明显改善。同样，足细胞特异性IGFBP7敲除（cKO^Nphs1）也能减轻肾小球损伤，但保护作用弱于肾小管特异性敲除。利用腺相关病毒（AAV）在肾小管特异性过表达IGFBP7可加重STZ诱导的肾脏损伤。挽救实验表明，在cKO小鼠中重新引入IGFBP7可逆转其保护效应。这些结果说明肾小管和足细胞来源的IGFBP7均参与DKD发病，但肾小管来源的IGFBP7是疾病进展的主要驱动因素。

IGFBP7抑制肾小管上皮细胞脂肪酸代谢

RNA测序分析显示，IGFBP7过表达显著抑制了脂肪酸代谢和氧化磷酸化等相关通路。实时PCR证实IGFBP7过表达下调了氧化磷酸化相关基因的表达，而敲低IGFBP7则可逆转此效应。IGFBP7还抑制了能量感受器AMPK信号通路及其下游关键调控因子PGC-1α的表达。海马能量代谢分析表明，IGFBP7过表达显著降低了肾小管上皮细胞的基础耗氧率，而线粒体脂肪酸氧化抑制剂依托莫司（etomoxir）的处理进一步证实了IGFBP7对脂肪酸氧化的抑制作用。油红O染色显示IGFBP7促进了高糖处理的肾小管上皮细胞内脂滴的积累。

肾小管源性IGFBP7促进高糖诱导的肾脏微环境紊乱

研究发现，高糖条件下肾小管上皮细胞IGFBP7表达和分泌均上调。用IGFBP7过表达的肾小管上皮细胞条件培养基处理足细胞和成纤维细胞，可分别加重足细胞标志物（WT-1, Nephrin）的下调和成纤维细胞纤维化标志物（COL-1, αSMA）的上调。重组IGFBP7蛋白可直接诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。此外，由IGFBP7 cKO小鼠肾脏构建的类器官在高糖刺激下，其纤维化反应较对照组（FF）显著减弱。这些结果证实肾小管来源的IGFBP7通过旁分泌作用扰乱肾脏微环境。

IGFBP7阻碍MDM2介导的STAT3泛素化降解

通过免疫共沉淀-质谱联用（Co-IP/MS）技术，鉴定出STAT3是IGFBP7在高糖应激下的主要结合蛋白。Co-IP、SPR、免疫荧光共定位和分子对接模拟均证实了IGFBP7与STAT3的直接相互作用。结构域映射将相互作用界面定位于STAT3的卷曲螺旋结构域（CCD）和IGFBP7的Kazal/Ig C2结构域。功能上，IGFBP7通过竞争性干扰STAT3与其E3泛素连接酶MDM2的结合，阻碍了MDM2介导的STAT3泛素化-蛋白酶体降解途径，从而稳定了STAT3蛋白水平。

IGFBP7通过靶向STAT3促进DKD进展

肾小管特异性STAT3条件性敲除（S3cKO）或AAV介导的STAT3敲低可减轻DKD小鼠的肾损伤。相反，在IGFBP7 cKO小鼠中通过AAV过表达STAT3，可逆转IGFBP7缺失带来的肾脏保护作用，重新加重肾功能损伤、纤维化和脂质积累。在IGFBP7 Tg小鼠中敲低STAT3则能减轻糖尿病肾损伤。这些结果明确了IGFBP7通过STAT3发挥其致病作用。

IGFBP7促进乙酰化STAT3二聚化进而抑制PGC-1α驱动的线粒体生物能量学

Co-IP实验表明，IGFBP7能促进STAT3的二聚化。这种促进作用依赖于STAT3的乙酰化，特别是K685位点的乙酰化。IGFBP7通过减弱去乙酰化酶SIRT2与STAT3的相互作用，从而促进STAT3乙酰化和二聚化。STAT3过表达可抑制线粒体生物能量学，而STAT3敲低则可缓解IGFBP7过表达引起的线粒体功能缺陷。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，STAT3可抑制PGC-1α的转录活性，而IGFBP7通过靶向乙酰化的STAT3来抑制PGC-1α介导的线粒体能量代谢。

LA作为IGFBP7拮抗剂缓解DKD进展

通过计算机辅助药物筛选超过24,000种化合物，研究者发现左旋亚叶酸（LA）能与IGFBP7结合，并破坏IGFBP7-STAT3相互作用。体外实验显示，LA能减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞纤维化标志物表达，恢复能量代谢，减少脂滴积累。在STZ诱导的1型DKD和HFD/STZ诱导的2型DKD小鼠模型中，LA治疗能显著降低蛋白尿，减轻肾纤维化、脂质沉积和肾小球超微结构损伤（如基底膜增厚、足突融合）。在晚期DKD的db/db小鼠模型中，LA同样显示出治疗效力，且停药后病理指标有轻微反弹，提示其持续治疗的重要性。重要的是，LA治疗未引起明显的全身毒性。

结论与意义

本研究系统阐明了IGFBP7在DKD发病机制中的核心作用。在DKD早期，肾小管上皮细胞中IGFBP7表达即持续上调，这主要由H3K4Me3表观遗传修饰驱动。升高的IGFBP7通过直接结合STAT3，干扰其MDM2介导的泛素化降解，促进STAT3乙酰化二聚化。活化的STAT3进而抑制PGC-1α的转录，导致线粒体脂肪酸氧化障碍、脂质沉积，最终触发炎症反应和纤维化，波及肾小球，引起肾小球硬化。研究首次揭示了“IGFBP7-STAT3-PGC-1α”轴是连接肾脏代谢紊乱与纤维化的重要通路。此外，发现的IGFBP7小分子抑制剂LA为DKD的靶向治疗提供了新的候选药物，展现了良好的转化应用前景。该研究深化了对DKD，特别是肾小管病变在疾病进程中作用的理解，为干预DKD进展提供了新的理论依据和潜在策略。