新型RNAi疗法KC13-M2G2有望实现慢性乙型肝炎的功能性治愈——临床前研究显示其强效抗病毒活性与良好安全性

《Nature Communications》：An RNA interference therapeutic potentially achieves functional cure of chronic hepatitis B virus infection

本研究针对慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染功能性治愈难题，开发了靶向HBV S区的GalNAc偶联siRNA药物KC13-M2G2。临床前研究表明，该药物能有效抑制所有HBV基因型的HBsAg和HBV DNA，并诱导HBsAb血清学转换，在动物模型中展现出优于现有临床药物elebsiran和bepirovirsen的疗效，且安全性良好，为慢性乙型肝炎治疗提供了新策略。

　　

在全球范围内，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响着约2.96亿人，是肝硬化和肝细胞癌的主要病因。当前的临床治疗方案主要依赖核苷（酸）类似物（NAs）和聚乙二醇化干扰素-α（IFN-α），但这些疗法存在局限性：NAs虽能抑制病毒复制，但通常需要终身服药，且难以实现乙肝表面抗原（HBsAg）转阴；IFN-α则因耐受性差而应用受限。慢性HBV感染的特征是肝细胞内共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在和病毒抗原（如HBsAg）的大量产生，高水平的HBsAg会导致免疫细胞耗竭，阻碍机体清除病毒。因此，降低循环中的HBsAg水平，为宿主免疫系统功能恢复创造窗口，是实现慢性乙型肝炎（CHB）功能性治愈的关键。然而，目前已进入临床研究的siRNA（如elebsiran、imdusiran等）和反义寡核苷酸（ASO，如bepirovirsen）药物，其单药治疗的功能性治愈率均不超过20%，远未达到世界卫生组织提出的2030年消除乙肝的目标。研发更高效的新疗法迫在眉睫。

本研究由北京友爱科创制药技术有限公司和杭州天龙制药有限公司的科学家团队完成，并发表在《Nature Communications》上。研究人员开发了一种名为KC13-M2G2的新型N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联小干扰RNA（siRNA），旨在强效抑制HBsAg，为慢性乙型肝炎的功能性治愈带来新希望。

研究采用生物信息学方法设计并筛选靶向HBV高度保守区域的siRNA候选分子，并通过体外细胞模型（如HepG2.2.15细胞、原代人肝细胞PHHs）评估其抗病毒活性。利用rAAV-HBV小鼠模型（模拟HBV基因型B、C、D的持续感染）和HBV转基因小鼠模型评估体内药效。通过SD大鼠和食蟹猴的重复给药毒性试验评价安全性。关键实验技术包括siRNA的化学合成与GalNAc修饰、细胞转染、化学发光免疫分析法（CLIA）检测病毒抗原（HBsAg, HBeAg）、定量PCR（qPCR）检测HBV DNA和RNA、酶联免疫斑点试验（ELISpot）分析免疫细胞反应、临床病理学检查以及流式细胞术分析淋巴细胞亚群等。

结果

siRNA的筛选与KC13-M2G2的确定

研究人员通过两轮筛选从26个初始siRNA候选物中确定了最有效的序列KC13，并优化其化学修饰模式（M2）和GalNAc配体（G2），最终得到先导化合物KC13-M2G2。在表达HBV的HepG2.2.15细胞中，KC13-M2G2对HBsAg、HBV DNA、HBeAg、HBV S mRNA和总HBV RNA的抑制活性（IC₅₀值在0.03-0.47 nM范围内）均优于阳性对照药elebsiran，且无细胞毒性。

KC13-M2G2的体外广谱抗病毒效力

KC13-M2G2的靶序列位于HBV S区。保守性分析显示，其反义链核心区（第2-19位）在占全球感染96%的A-E基因型中保守性≥79.7%，种子区（第2-8位）在所有A-H基因型中保守性达93.9%。在转染了十种不同基因型（A-J）HBV质粒的HepG2细胞中，KC13-M2G2对所有基因型的HBsAg均表现出皮摩尔级别的抑制活性（IC₅₀范围0.0018-0.0209 nM），表明其具有广谱抗病毒潜力。

潜在的脱靶效应分析

通过生物信息学分析和体外验证，研究人员评估了KC13-M2G2可能存在的微小RNA（miRNA）样脱靶效应。在HepG2.2.15细胞中，即使在高浓度（30 nM）下转染，也未观察到对预测的13个潜在脱靶基因的明显下调，且其反义链序列与人类miRNA数据库中的序列无高度相似性，提示其脱靶风险较低。

在rAAV-HBV小鼠模型中的体内抗病毒活性

在携带HBV基因型B、C或D的rAAV-HBV小鼠模型中，每周皮下注射3 mg/kg的KC13-M2G2，连续三次，可快速、持续地降低血浆HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平。在rAAV-HBV-B和-C小鼠中，分别有10/10和9/10的小鼠实现了HBsAg和HBV DNA的清除，且无反弹。尤为重要的是，在HBsAg清除的同时，部分小鼠（rAAV-HBV-B: 8/10; rAAV-HBV-C: 3/10）出现了乙肝表面抗体（HBsAb，≥12 mIU/mL）的血清学转换，这是功能性治愈的重要标志。在rAAV-HBV-D小鼠中，KC13-M2G2的疗效呈剂量依赖性，在1和3 mg/kg剂量组中，HBsAg和HBV DNA的清除率以及HBsAb血清学转换率均高于阳性对照药elebsiran和bepirovirsen。恩替卡韦（ETV）仅能抑制HBV DNA，对HBsAg无影响。肝组织RNA分析也证实了KC13-M2G2能剂量依赖性地降低肝内HBV S RNA和总HBV RNA水平。

在高HBsAg基线小鼠模型中的疗效

为了模拟临床中HBsAg基线水平较高的难治性患者，研究者在HBsAg基线约20000 IU/mL的rAAV-HBV-D小鼠模型中评估KC13-M2G2的疗效。结果显示，KC13-M2G2（3 mg/kg，每周一次，共三次）能诱导HBsAg和HBV DNA的持续抑制直至研究结束（第189天），且10只小鼠中有6只实现了HBsAg清除和HBsAb血清学转换。而elebsiran和bepirovirsen的疗效则相对有限。

在HBV转基因小鼠模型中的疗效

在携带HBV基因型A基因组并表达病毒抗原的HBV转基因小鼠中，KC13-M2G2同样表现出强效的抗病毒活性。3 mg/kg剂量的KC13-M2G2治疗可使几乎所有小鼠（5-6/6只）的HBsAg降至检测限以下，且疗效持续至研究终点。单次给药（3 mg/kg）即可引起HBsAg最大降低3 log₁₀ IU/mL，并在部分小鼠中实现HBsAg清除。

在SD大鼠和食蟹猴中的安全性评价

在SD大鼠中进行的4周重复给药毒性试验中，KC13-M2G2的最高测试剂量为200 mg/kg（每两周一次，共三次）。主要异常发现包括200 mg/kg组动物在给药后第15天出现总胆红素（BIL-T）和碱性磷酸酶（ALP）的一过性升高，以及肝细胞和库普弗细胞的轻微空泡化。动物对该剂量耐受良好，未出现与试验物品相关的死亡或其他严重不良反应。最大耐受剂量（MTD）为200 mg/kg，未见不良反应水平（NOAEL）为50 mg/kg。在食蟹猴中进行的类似试验中，即使给予最高剂量（200 mg/kg），也未观察到与试验物品相关的临床病理学异常或体重变化。显微镜下观察到的变化（如肝脏库普弗细胞嗜碱性变、肝细胞空泡化、淋巴结泡沫状巨噬细胞增多等）被认为是KC13-M2G2相关的、非不良的。食蟹猴的NOAEL被确定为200 mg/kg。

免疫原性评价

在SD大鼠和食蟹猴中，系统评估了KC13-M2G2的免疫原性。结果显示，KC13-M2G2给药后，血清中白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子水平，以及淋巴细胞及其亚群（总T细胞、细胞毒性T细胞、辅助性T细胞）的绝对数量和百分比，均与生理盐水对照组无显著变化，表明KC13-M2G2在试验条件下未引发明显的免疫刺激反应。

讨论与结论

本研究表明，KC13-M2G2是一种极具潜力的治疗慢性乙型肝炎的siRNA候选药物。其在临床前研究中展现出对多种HBV基因型的强效、广谱抗病毒活性，能够诱导HBsAg的快速、持续清除，并伴随HBsAb的血清学转换，这是实现功能性治愈的关键指标。其疗效显著优于目前已进入临床阶段的siRNA药物elebsiran和ASO药物bepirovirsen。在SD大鼠和食蟹猴中进行的毒理学研究显示了其良好的安全性特征。

该研究的发现具有重要意义。首先，它证实了通过优化siRNA的序列和化学修饰，可以极大提高其抗HBV效力，从而实现单药治疗下HBsAg的深度清除和免疫重建，这可能改变了以往认为siRNA单药难以实现功能性治愈的看法。其次，研究指出，对于高度变异的病毒如HBV，siRNA设计时，反义链第2-12位（种子区和中央区）的完全互补可能比传统认为的第2-19位更为关键，这为未来针对高变异病毒设计RNAi药物提供了新思路。此外，KC13-M2G2在HBsAg高基线水平动物模型中的成功，预示着其可能对更广泛的CHB患者群体有效。

当然，研究也存在一些局限性，例如所使用的动物模型（rAAV-HBV小鼠、HBV转基因小鼠）不能完全模拟HBV在人体内的自然感染和传播过程；更长期的毒性评价仍在进行中；与免疫调节剂（如治疗性疫苗、IFN-α）的联合治疗策略有待进一步探索。

总之，KC13-M2G2在临床前研究中表现出的卓越疗效和良好安全性，使其成为慢性乙型肝炎功能性治愈领域一个非常有希望的候选药物，值得进一步的临床开发。这项研究由Ze-Ao Huang、Yang Yang、Shuo Yang等作者共同完成，为攻克慢性乙型肝炎这一全球性健康难题带来了新的希望。