干扰素通过ATRX增强H3K9me3表观遗传记忆抑制HSV-1神经元潜伏再激活的机制研究

《Nature Communications》：Interferon dependent immune memory during HSV-1 neuronal latency via increased H3K9me3 and restriction by ATRX

本研究揭示了I型干扰素（IFNα）处理通过促进PML核体（PML-NB）形成，招募组蛋白伴侣DAXX，增加潜伏HSV-1基因组上抑制性组蛋白标记H3K9me3的富集，并鉴定ATRX作为关键的H3K9me3阅读器在神经元中持续性结合病毒基因组，从而抵抗再激活刺激，阐明了神经元内在免疫记忆抑制疱疹病毒再激活的新表观遗传机制。

　　

疱疹 simplex virus 1（HSV-1）是一种能够建立终身潜伏感染的病原体，它入侵神经元后便进入“休眠”状态，但其基因组并未消失，而是静静地潜伏在神经元细胞核内。这种潜伏状态并非坚不可摧，在特定条件下，例如免疫抑制、应激或外界刺激下，病毒会从沉睡中“苏醒”，重新进入活跃复制状态，这一过程称为再激活。再激活会导致一系列疾病，从令人烦恼的口唇疱疹（cold sores）到威胁视力的疱疹性角膜炎，甚至致命性的疱疹性脑炎。因此，理解HSV-1如何在神经元中维持潜伏，以及为何某些潜伏的病毒基因组更容易被再激活，是疱疹病毒研究领域的核心挑战之一。

长期以来，科学家们知道潜伏的HSV-1基因组被一种称为异染色质的紧密压缩的染色质结构所包裹，上面富含多种抑制性的组蛋白修饰标记，例如H3K9me3（组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化）。这些标记像一个个“锁”，帮助关闭病毒基因的表达。然而，潜伏的病毒基因组群体并非均一的，有些基因组可能带有更强的“锁”，而有些则相对容易“解锁”。是什么因素决定了这种异质性？神经元自身的状态，比如在初次感染时是否遭遇了免疫信号，是否会像形成记忆一样，长久地影响病毒基因组的“沉默”强度，从而改变其未来再激活的潜能？这些问题尚未得到解答。

此前的研究表明，如果在HSV-1初次感染神经元时同时给予I型干扰素（IFNα）处理，会显著抑制后续的病毒再激活。这种抑制效应依赖于一种名为早幼粒细胞白血病核体（PML-NB）的核内结构的形成。PML-NB像细胞核内的一个“指挥中心”，能够招募多种蛋白。但是，PML-NB本身是否需要在漫长的潜伏期持续存在来维持这种抑制？它又是通过何种机制实现对再激活的长效抑制？这些关键机制一直笼罩在迷雾之中。

为了解开这些谜团，来自美国弗吉尼亚大学安娜·R·克利夫（Anna R. Cliffe）课题组的研究团队在《自然-通讯》（Nature Communications）上发表了他们的最新研究成果。他们发现，IFNα通过诱导PML-NB形成，在病毒感染初期将组蛋白伴侣DAXX招募至病毒基因组，从而增加了抑制性标记H3K9me3在潜伏病毒基因组上的富集。更重要的是，他们鉴定出ATRX（α-地中海贫血/智力低下综合征X连锁蛋白）这一在神经元中高表达的蛋白，作为H3K9me3的“阅读器”，能够持久地结合在带有H3K9me3标记的病毒基因组上。即使面对再激活初期发生的组蛋白磷酸化（即“甲基/磷酸开关”，H3K9me3S10ph），ATRX也“坚守岗位”，不被驱逐，从而有效地阻止了病毒基因的表达和再激活的进程。这项研究不仅揭示了神经元内在免疫记忆抑制病毒再激活的新机制，还指出了ATRX作为一个潜在的干预靶点，为未来开发抑制HSV-1再激活的新策略提供了重要理论基础。

本研究主要运用了几项关键技术：首先，建立了小鼠颈上神经节（SCG）原代神经元体外潜伏感染HSV-1模型，并使用表达Us11-GFP的病毒（Stayput-GFP）可视化再激活。其次，利用慢病毒介导的shRNA在感染前或潜伏建立后敲低特定基因（如PML、DAXX、ATRX），并结合Cre-loxP系统在条件性基因敲除神经元中进行功能验证。第三，采用先进的单基因组分析工具NucSpotA，通过免疫荧光定量分析单个病毒基因组上与特定蛋白（如H3K9me3， ATRX）的共定位情况。第四，运用CUT&Tag（靶向切割与标签化）技术在全基因组范围内绘制潜伏病毒基因组上H3K9me3的富集图谱。此外，还通过RT-qPCR检测病毒裂解基因表达，以及在不同氧浓度（常氧21% O₂与生理氧5% O₂）下培养神经元以模拟更真实的生理环境。

研究结果

PML在起始而非维持IFNα诱导的潜伏抑制中起作用

研究人员首先验证了IFNα预处理对HSV-1再激活的抑制效应。他们发现，在感染前敲低PML，可以逆转IFNα的抑制效果，使再激活水平恢复到未处理对照的水平。然而，令人意外的是，在潜伏感染建立后再敲低PML，并不能解除IFNα诱导的再激活抑制。这表明PML-NB在感染初期是建立这种“沉默记忆”所必需的，但在潜伏期维持这种沉默状态时却并非必需。进一步探究发现，当神经元在生理性氧浓度（5% O₂，更接近体内环境）而非常氧（21% O₂）下培养时，IFNα诱导的PML-NB在感染初期形成，但到了潜伏期（10天后），这些PML-NB大多消失，且与病毒基因组的共定位也显著减少。这解释了为何在更生理的条件下，PML在潜伏期不再起维持作用，也提示了体外培养条件对研究结果的重要影响。

IFNα诱导的抑制效应依赖于DAXX

由于PML本身不直接维持沉默，研究者将目光转向PML-NB的其他组分。DAXX是PML-NB的一个组成性蛋白，在裂解感染中已知能抑制HSV-1。结果显示，在感染前敲低DAXX，同样能逆转IFNα对再激活的抑制。与PML类似，DAXX在感染初期与病毒基因组共定位，但在潜伏期其共定位消失。并且，DAXX向病毒基因组的招募完全依赖于PML。这些结果表明，DAXX是IFNα-PML通路下游起始抑制效应的关键执行者。

IFNα增加病毒基因组上H3K9me3的富集

既然DAXX与组蛋白H3.3的沉积和异染色质形成有关，研究者推测IFNα处理可能改变了潜伏病毒基因组的表观遗传状态，特别是增加了H3K9me3的富集。通过NucSpotA单基因组分析，他们发现，在未处理神经元中，约49.3%的潜伏病毒基因组与H3K9me3共定位；而经IFNα处理后，这一比例显著上升至75.3%。在感染前敲低PML或DAXX，均能阻断IFNα引起的H3K9me3富集增加。然而，在潜伏建立后敲低PML或DAXX，则不影响H3K9me3的水平。这进一步证实PML/DAXX通路在感染初期“设定”了H3K9me3标记，但该标记一旦建立，便可在潜伏期独立维持。全基因组范围的CUT&Tag分析也证实，IFNα处理增加了H3K9me3在病毒基因启动子和基因体区域的富集。

ATRX作为H3K9me3阅读器限制HSV-1再激活且其作用被IFNα增强

H3K9me3的沉默效应需要通过其“阅读器”蛋白来实现。ATRX是一个已知的H3K9me3阅读器，且能与DAXX形成复合物。研究发现，无论是在感染前还是潜伏建立后敲低ATRX，都能显著增强IFNα预处理神经元中的病毒再激活。这与PML和DAXX仅在感染前敲低有效形成了鲜明对比，表明ATRX是维持潜伏期沉默状态所必需的。免疫荧光显示，ATRX在潜伏期持续与病毒基因组共定位，且IFNα处理显著增加了其共定位比例（从43%增至75%）。这种增加在感染初期依赖于PML，但在潜伏期则不再依赖。值得注意的是，ATRX在神经元中的本底表达水平远高于成纤维细胞，即使在未处理神经元中，ATRX也显著富集于病毒基因组上。敲低ATRX（而非PML或DAXX）在未处理神经元中也能增强再激活，表明ATRX具有不依赖于PML/DAXX通路的内在限制再激活的功能。

ATRX与H3K9me3共同存在于病毒基因组并抵抗再激活初期的“甲基/磷酸开关”

进一步机制探索发现，ATRX的富集与H3K9me3标记高度重叠。在再激活的第一阶段（Phase I），细胞应激信号会引发JNK通路活化，导致H3K9me3相邻的丝氨酸10磷酸化（H3K9me3S10ph）。这个“甲基/磷酸开关”通常会驱逐一些H3K9me3阅读器（如HP1），从而允许基因转录而不必先去除甲基化标记。然而，本研究显示，在再激活刺激后，ATRX仍然牢牢地结合在病毒基因组上，即使H3K9me3S10ph已经发生。同时，ATRX的缺失会导致再激活第一阶段病毒裂解基因（ICP27， ICP8， gC）表达的显著增加，说明ATRX通过阻止病毒基因组进入再激活第一阶段来发挥限制作用。此外，抑制H3K9me3去甲基化酶KDM4，在ATRX存在时对再激活无影响，但在ATRX缺失时则会抑制再激活，这反过来说明当ATRX这个“守护者”缺席时，去除H3K9me3标记就变得对再激活至关重要了。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了I型干扰素信号在神经元中诱导长效抗病毒表观遗传记忆的机制通路：IFNα → PML-NB形成 → DAXX招募 → H3K9me3沉积增加 → ATRX持续性结合 → 抵抗再激活刺激。其主要结论包括：1）免疫信号（IFNα）在感染初期可通过PML-NB和DAXX途径，持久地改变潜伏HSV-1基因组的表观遗传景观，增加H3K9me3异染色质的比例；2）ATRX被鉴定为神经元中关键的H3K9me3阅读器，是维持潜伏沉默、限制再激活的核心限制因子；3）ATRX的限制机制在于其能够抵抗再激活初期发生的“甲基/磷酸开关”，持续结合病毒基因组并抑制第一阶段裂解基因的表达；4）神经元高表达的ATRX可能部分解释了HSV-1潜伏的特异性细胞类型选择。

这项研究的创新性和重要意义在于：首先，它是首篇报道神经元在免疫刺激下产生长效表观遗传记忆以控制潜伏病毒再激活的研究，深化了对神经元内在免疫的理解。其次，它揭示了潜伏病毒基因组群体的表观遗传异质性及其功能意义（即H3K9me3/ATRX富集的基因组更难以再激活），并阐明了这种异质性可以被外部免疫信号所调节。第三，它发现了ATRX在神经元中不同于其在非神经元细胞中（与DAXX协同）的作用模式，凸显了细胞类型特异性机制的重要性。最后，该研究鉴定出的ATRX-H3K9me3轴，为未来开发靶向表观遗传阅读器以控制HSV-1再激活、预防相关疾病的治疗策略提供了新的潜在靶点和思路。