长读长基因组测序解析NF2相关神经鞘瘤病中8号与22号染色体平衡易位的断点

《Scientific Reports》：Long-read genome sequencing resolves the breakpoints of a chromosome 8;22 balanced translocation in NF2-related schwannomatosis

本研究针对染色体平衡易位断点定位难题，利用纳米孔长读长测序技术，对一例携带t(8;22)(q13.3;q11.23)易位且罹患NF2相关神经鞘瘤病的患者进行全基因组测序。研究成功在核苷酸水平精准解析了易位断点，证实其破坏了NF2基因，揭示了该罕见病的分子病因。此案例凸显了长读长测序在提升复杂结构变异诊断精度方面的巨大潜力，为遗传咨询和生殖医学提供了关键依据。

　　

在遗传诊断领域，染色体平衡易位如同一道复杂的谜题。当两条染色体片段交换位置，但遗传物质总量看似不增不减时，这种“平衡”状态往往暗藏玄机。尤其当这种易位是“新生”的（即非父母遗传），它可能导致基因断裂或调控序列破坏，从而引发一系列发育异常或疾病，给产前诊断和遗传咨询带来巨大的不确定性。传统的细胞遗传学技术，如核型分析，能够发现大的易位，但就像一张低分辨率的地图，无法精确指示断裂发生在哪个基因的哪个位置。对于神经纤维瘤病2型（NF2相关神经鞘瘤病）这类由NF2肿瘤抑制基因突变引起的遗传性肿瘤综合征，明确致病元凶至关重要。

NF2相关神经鞘瘤病患者易患双侧前庭神经鞘瘤、脑膜瘤和室管膜瘤等多种肿瘤。约半数病例为家族遗传，另一半则为自身的新发突变。除了常见的点突变或小的缺失/重复，一些病例与22号染色体的结构异常有关，例如环状染色体22或涉及22号染色体长臂的易位。然而，过去的技术手段，如荧光原位杂交（FISH）、Southern印迹甚至短读长下一代测序（NGS），在解析这些易位的精确断点时常常力有不逮，特别是在重复序列区域，难以达到核苷酸级别的分辨率。这就导致即使发现了易位，也无法最终确认其是否以及如何破坏了NF2基因，使得病因诊断存在空白。

为了解决这一难题，一项发表在《Scientific Reports》上的研究展示了前沿的长读长测序技术如何破解这一谜团。研究人员对一例在孕期即被发现携带新生平衡易位t(8;22)(q13.3;q11.23)，并在青少年时期确诊为NF2相关神经鞘瘤病的女性患者，进行了纳米孔（Nanopore）长读长全基因组测序。该研究旨在精确绘制易位断点，探究其与NF2基因的关联，从而明确疾病的分子基础。

为开展此项研究，团队采用了几个关键技术方法：从患者样本中提取高质量基因组DNA，使用牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies）的PromethION平台进行长读长全基因组测序，获得了约14倍覆盖深度的数据。利用Sniffles2、SVIM等专门针对长读长数据的结构变异（SV）调用工具进行断点分析，并通过Nano-GLADIATOR进行拷贝数变异（CNV）验证。最后，通过PCR扩增和Sanger测序对纳米孔测序发现的断点进行了实验验证。样本来源于单一病例的临床诊断过程。

结果

案例展示与初步分析

患者为一名15岁女性，因头痛、恶心和不稳定感就诊。磁共振成像（MRI）发现其患有双侧 cerebellopontine angle（ cerebellopontine angle）肿瘤、延髓-脊髓交界处疑似室管膜瘤以及大脑镰脑膜瘤等多种病变，临床诊断为NF2相关神经鞘瘤病。追溯其病史发现，患者出生前因母亲高龄而行羊膜穿刺术，核型分析显示为46,XX,t(8;22)(q13.3;q11.23)，父母核型正常，证实为新生易位。尽管后期的高分辨率熔解曲线（HRM）分析和多重连接依赖性探针扩增（MLPA）均未在NF2基因上发现致病性点突变或大片段缺失/重复，180K阵列比较基因组杂交（array-CGH）也未在8q13.3或22q11.23区域检测到缺失，但研究者始终怀疑该易位是导致NF2基因功能丧失的根源。

纳米孔长读长测序鉴定NF2基因内的易位断点

纳米孔测序产生了总计约44 Gb的数据，平均覆盖深度为14.22倍。通过对测序数据的深入分析，研究团队成功定位了易位断点的精确坐标：染色体8（GRCh38）：g.69,290,900和染色体22（GRCh38）：g.29,648,858。

进一步的序列分析显示，染色体8的断点位于LINC01592和SULF1基因之间的 intergenic region（基因间区），而染色体22的断点则恰恰落在NF2基因的第4内含子（intron 4）内。这一发现直接证实了易位事件导致了NF2基因结构的破坏。通过设计跨越断点的特异性引物进行PCR和Sanger测序，该断点得到了湿实验的验证。分析还发现在易位连接处存在5个碱基（GGATT）的微同源性（microhomology），提示易位形成可能涉及微同ology介导的修复机制。

阵列CGH与纳米孔方法在微缺失检测中的比较

虽然阵列CGH未能检出与NF2相关的缺失，但发现了三个小的 interstitial heterozygous deletion（间质杂合性缺失），分别涉及EXOC4、GPHN和TOP3B基因。研究团队进一步利用纳米孔数据验证这些发现。Sniffles2成功确认了EXOC4和GPHN的缺失，而TOP3B的缺失则需借助专门用于CNV分析的Nano-GLADIATOR工具才能可靠检测到，这展示了纳米孔测序在检测不同类型结构变异方面的互补性和灵活性，这些微缺失被评估为可能良性的变异或意义不明确的变异，与NF2表型无关。

讨论与结论

本研究首次应用纳米孔长读长测序技术，在分子水平上阐明了一例由新生平衡易位t(8;22)导致的NF2相关神经鞘瘤病。研究的关键发现在于，通过高精度断点定位，证实了易位直接破坏了NF2肿瘤抑制基因。这解释了患者的发病机制：易位导致一个NF2等位基因功能丧失（单倍体不足），使得个体易感，随后在特定细胞中发生第二个NF2等位基因的体细胞失活（即“二次打击”模型），最终触发肿瘤形成。

该案例凸显了长读长测序在临床遗传诊断中的革命性价值。与传统技术相比，它能提供核苷酸级别的分辨率，明确判断结构变异是否破坏了关键基因的编码区或调控元件，从而将“意义不明确的变异”转化为明确的致病原因。这对于携带新生平衡易位的个体及其家庭的遗传咨询、风险评估乃至未来的生殖选择（如植入前遗传学检测）具有至关重要的指导意义。

随着长读长测序技术准确度、通量的不断提升和成本的持续下降，将其整合入针对复杂结构变异的常规诊断流程已成为可能的发展趋势。这项研究为这一趋势提供了有力的实证，表明长读长测序有望显著提高遗传病的诊断率，深化我们对基因组结构变异致病机制的理解，并最终推动精准基因组医学的发展。