基于适配体-抗体夹心法的登革热NS1蛋白侧向层析检测技术开发与应用

《Scientific Reports》：Expression and purification of NS1 protein for designing a lateral flow assay-based aptamer-antibody

本研究针对登革热早期诊断成本高、耗时长的问题，开发了一种基于适配体（Aptamer）与抗体夹心法的金纳米颗粒（AuNPs）侧向层析检测技术（LFA）。通过重组表达DENV2 NS1蛋白，构建了特异性识别NS1的适配体-抗体夹心体系，实现在缓冲液和血清中分别达到5.2 ng/mL和6.1 ng/mL的检测灵敏度。该技术具有快速（10分钟）、低成本、高特异性等优势，为资源有限地区的登革热早期诊断提供了新方案。

　　

在热带和亚热带地区，登革热（Dengue Fever）已成为严重的公共卫生威胁。据世界卫生组织（WHO）统计，全球约有39亿人面临感染风险，其中亚洲地区病例占70%。登革病毒（DENV）存在四种血清型（DEN-1至DEN-4），感染后可能发展为登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS），死亡率较高。目前，酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）是主流诊断方法，但成本高、耗时长，难以在资源匮乏地区普及。因此，开发快速、灵敏、低成本的现场检测技术迫在眉睫。

登革病毒的非结构蛋白NS1（Non-structural Protein 1）是早期感染的关键生物标志物，其在发病后第4天达到峰值。本研究团队通过重组表达DENV2 NS1蛋白，构建了一种新型侧向层析检测（Lateral Flow Assay, LFA）平台，结合适配体（Aptamer）与抗体的双重识别优势，实现了对NS1蛋白的高灵敏度检测。该研究发表于《Scientific Reports》，为登革热早期诊断提供了创新解决方案。

关键技术方法包括：首先通过原核表达系统（pET-23b载体）在大肠杆菌（E. coli）中重组表达NS1蛋白，并经镍柱亲和层析（Ni²⁺-NTA）纯化；其次，采用柠檬酸钠还原法合成金纳米颗粒（AuNPs），并通过硫醇化修饰将NS1特异性适配体固定于AuNPs表面；最后，在硝化纤维素膜上分别固定捕获抗体和生物素化互补序列，构建夹心法检测体系。血清样本来源于人工加标的人血清，用于模拟真实检测环境。

表达与纯化NS1蛋白

研究人员将DENV2 NS1基因克隆至pET-23b载体，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，通过镍柱亲和层析从包涵体中纯化获得重组NS1蛋白（rNS1）。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）结果显示单一目标条带（约48-50 kDa），证实蛋白纯度满足实验要求。

金纳米颗粒与适配体复合物表征

通过紫外-可见光谱（UV-Vis）和动态光散射（DLS）对AuNPs及其适配体复合物进行表征。未修饰的AuNPs在525 nm处出现表面等离子共振（SPR）特征峰，适配体结合后峰位红移2-3 nm，表明成功偶联。DLS显示颗粒平均粒径为30 nm，多分散指数（PDI）为0.224，符合层析检测要求。

侧向层析检测性能分析

在缓冲液体系中，该LFA对NS1的检测限（LOD）为5.2 ng/mL（95% CI: 4.6-5.8）；在加标人血清中为6.1 ng/mL（95% CI: 5.5-6.8）。通过ImageJ量化信号强度并结合逻辑回归分析，证实该方法具有高灵敏度。特异性实验显示，该体系对DENV1、DENV3、DENV4、寨卡病毒（ZIKV）和黄热病毒（YFV）的NS1蛋白均无交叉反应。主成分分析（PCA）进一步表明，DENV2与其他病毒信号在矩阵中显著分离（PC1=82%，PC2=12%）。

结论与意义

本研究成功开发了一种基于适配体-抗体夹心法的侧向层析检测技术，能够在10分钟内实现登革热NS1蛋白的快速、高特异性检测。其灵敏度与传统ELISA相当，但成本更低、操作更简便，尤其适用于医疗资源有限的地区。未来通过优化适配体序列、引入多路检测线，该平台有望扩展至其他血清型或病毒诊断，成为现场筛查的有力工具。