强效的预构吡唑烷环亲菌素D抑制剂能够防止小鼠胰腺炎疾病模型中的线粒体和器官损伤

《Journal of Medicinal Chemistry》：Potent Preorganized Pyrazolidine Cyclophilin D Inhibitors Prevent Mitochondrial and Organ Injury in a Mouse Pancreatitis Disease Model

本研究通过将吡咯烷环替换为吡唑啉环并引入糖苷基团，合成了新型环孢素D（CypD）抑制剂。该抑制剂系列表现出>40倍的高亲和力和>200倍的高抑制活性，显著优于传统环孢素A。体外实验证实其能有效抑制MPTP开放和钙超载诱导的细胞坏死，体内实验中化合物18f在50 mg/kg剂量下显著降低急性胰腺炎小鼠的淀粉酶、MPO活性及胰腺坏死程度。结构分析和分子模拟表明，吡唑啉环的预构象优化了与CypD结合口袋的契合度，糖苷基团增强了代谢稳定性和水溶性。

　　
本研究聚焦于开发新型环孢素D（CypD）抑制剂，重点考察了分子结构改造对抑制活性、结合亲和力及药代动力学特性的影响。研究团队通过将传统抑制剂中的吡咯烷环替换为刚性更强的吡咯嗪环，实现了对CypD抑制能力的显著提升。这种结构改造不仅增强了化合物与靶点蛋白的结合能力，还通过优化左臂糖基化结构改善了代谢稳定性和生物利用度，最终在急性胰腺炎动物模型中显示出显著的疗效。

### 1. 研究背景与意义
线粒体通透性转换孔道（MPTP）的异常开放是多种器官损伤的共性病理机制。CypD作为MPTP的关键调控蛋白，其抑制剂在心肌缺血、神经退行性疾病及急性胰腺炎等治疗中具有潜在价值。然而，传统抑制剂如环孢素A（CsA）存在分子量过大（>1000 Da）、水溶性差、首过效应显著及免疫抑制副作用等问题。本研究通过结构创新，旨在开发更高效、更安全的CypD抑制剂。

### 2. 核心发现与创新点
#### 2.1 吡咯嗪（Pz）环取代的突破性进展
研究团队发现，将吡咯烷（Pyr）环替换为吡咯嗪环可带来量级提升的活性增强。例如，化合物12a的PPIase抑制常数（Ki）从Pyr类似物4a的960 nM提升至32 nM，结合亲和力（Kd）从2000 nM优化至60 nM，活性提升超过40倍。这种效果源于Pz环的刚性结构，其自然形成的顺式酰胺构象（cis-amide geometry）更精准地契合CypD结合口袋的S1'口袋，特别是通过芳环π-π堆积和疏水相互作用增强了对关键氨基酸残基（如Arg55、Phe113、Leu122）的锚定能力。

#### 2.2 糖基化左臂的协同优化
受Gr?dler团队启发，研究将糖基化结构引入左臂（LHS），发现其可进一步强化抑制效果。例如，糖基化化合物18c的Ki降至1.9 nM，Kd为40 nM，较未糖基化Pz类似物12c的活性提升超过100倍。这种增强主要源于糖基的羟基与CypD Ser81、Arg82等残基形成额外的氢键网络，同时通过空间位阻优化了S2口袋的结合模式。

#### 2.3 代谢稳定性的显著改善
通过对比Pyr与Pz系列化合物的药代动力学数据，研究发现糖基化结构能有效降低代谢稳定性风险。例如，化合物18c的肝脏微somal代谢清除率（CLint）仅为47.3 μL/min/mg，而其对应的Pyr类似物4c的CLint高达174.2 μL/min/mg。糖基的引入不仅提高了水溶性（18c的溶解度达765 μM），还通过减少N-氧化代谢途径使代谢稳定性提升3-5倍。

### 3. 体外活性验证
#### 3.1 线粒体钙容量保留（CRC）实验
采用钙荧光探针（Calcium Green 5N）评估抑制剂对线粒体MPTP开放的影响。在300 nM浓度下，Pz化合物18d和18f的CRC保护率分别达到4.4倍和5.0倍，显著优于CsA（4.7倍）。值得注意的是，这些化合物在敲除CypD的Ppif-/-小鼠线粒体中未显示保护作用，证实其抑制机制特异性。

#### 3.2 细胞坏死抑制实验
通过taurolithocholic acid（TLCS）诱导的胰腺外分泌细胞（PACs）坏死模型，验证了化合物18b-18f的疗效。0.1 μM浓度的18c即可将坏死率从对照组的78.6%降至12.3%，且其效果在多种代谢背景下均保持稳定。与CsA相比，18f在50 mg/kg剂量下展现出更优的剂量-反应关系。

### 4. 体内药效验证
#### 4.1 CER-AP急性胰腺炎模型
采用经典的7次 cerulein注射诱导急性胰腺炎模型，化合物18f在50 mg/kg剂量下显示出显著疗效：血清淀粉酶活性降低42%，胰腺组织髓过氧化物酶（MPO）活性下降68%，水肿面积减少55%，炎症细胞浸润减少73%。这种剂量依赖性响应与体外CRC实验结果高度一致。

#### 4.2 药代动力学特性
化合物18f在体内的暴露量（AUC）达到1633 ng/mL·h，半衰期（t1/2）为3.7小时，表明其具有较长的药代半衰期。药代动力学数据显示其经肝CYP3A4代谢比例仅为1.2%，显著优于CsA（代谢率>20%），这与其糖基化左臂的结构特性密切相关。

### 5. 结构优化策略与分子机制
#### 5.1 右臂（RHS）的疏水优化
通过在RHS引入邻位氯取代基（如12b的2,5-二氯结构），可增强与Leu122和Phe59的疏水相互作用。分子对接显示，Cl取代基的范德华体积与原Pyr环的甲硫氨酸残基高度匹配，使结合自由能（ΔG）降低达-8.3 kcal/mol。

#### 5.2 左臂糖基化协同效应
糖基的羟基与CypD Ser81形成氢键（距离2.0 ?），同时通过糖环的π-π堆积与Arg82残基的胍基形成立体效应。这种双机制作用使糖基化Pz化合物的Ki值普遍低于2 nM，而Pyr类似物的最低Ki值为560 nM。

#### 5.3 转化异构酶（PPIase）抑制机制
X射线晶体学显示，化合物12a的顺式酰胺构象使其Nα与CypD的Trp68形成T-shaped π-π堆积，距离达3.8 ?。这种构象预组织化（preorganization）减少了分子柔性带来的构象熵损失，使ΔG结合值优化至-25.3 kcal/mol。

### 6. 药物开发前景
本研究建立了从Pyr到Pz的结构优化路径，并通过糖基化左臂实现了代谢稳定性的突破。目前最具潜力的候选化合物18f已通过以下验证：
- 体外抑制活性：Ki=2.4 nM，Kd=10 nM
- 体内药效：在50 mg/kg剂量下可完全抑制胰腺坏死
- 药代特性：logD7.4=3.9，t1/2=3.7小时，清除率（CLint）为43.6 μL/min/kg

未来研究可聚焦于：
1. CypD亚型选择性优化（如靶向CypD2在胰腺中的高表达）
2. 纳米制剂递送系统的开发（利用糖基化结构实现被动靶向）
3. 代谢稳定性强化（如引入氟苯基替代糖基氧原子）

### 7. 研究局限与改进方向
当前研究的局限性包括：
- 未考察CypD在心脏、脑等器官中的亚型差异
- 糖基化可能增加分子免疫原性（需进一步验证）
- 代谢途径中尚未完全排除CYP2C9酶的潜在作用

建议后续工作可：
1. 采用多组学技术分析CypD抑制剂在胰腺组织中的蛋白表达谱
2. 开展ADME筛选（如溶血素实验评估糖基化程度的影响）
3. 优化左臂糖基的连接方式（如半乳糖替代葡萄糖）

本研究为MPTP相关疾病的治疗提供了新的分子工具，其结构创新策略（刚性环替代+糖基化左臂）为后续开发下一代CypD抑制剂奠定了理论基础和技术路径。