西达本胺通过抑制HDAC3/HNF4A/TYMS轴增强胃癌对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的机制研究

《Cell Death & Disease》：Chidamide enhances the sensitivity of gastric cancer to 5-fluorouracil chemotherapy by suppressing the HDAC3/HNF4A/TYMS axis

本研究针对胃癌(GC)对5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗易产生耐药性的临床难题，探讨了组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺(Chidamide)的增敏作用。研究人员发现西达本胺通过抑制HDAC3，增强HNF4A在K458位点的乙酰化并降低其S313位点的磷酸化，进而下调胸苷酸合成酶(TYMS)表达，最终逆转GC对5-FU的耐药性。该研究为临床克服GC化疗耐药提供了新的联合治疗策略。

　　

胃癌是全球范围内，尤其是在中国，发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤。数十年来，以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础的化疗方案一直是晚期胃癌的标准治疗手段。然而，一个严峻的临床现实是，几乎所有患者最终都会对5-FU产生耐药性，导致治疗失败，患者的中位无进展生存期往往不足一年。因此，深入揭示胃癌对5-FU耐药的分子机制，并寻找有效的逆转策略，是当前胃癌研究领域亟待解决的关键科学问题。

在此背景下，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂为肿瘤治疗带来了新的希望。西达本胺(Chidamide)是我国自主研发的首个口服亚型选择性HDAC抑制剂，已获批用于某些淋巴瘤的治疗。前期研究表明，西达本胺在结直肠癌等其他癌种中与5-FU联用能产生协同抗肿瘤效应，但其在胃癌中能否逆转5-FU耐药，以及其具体的作用机制尚不明确。5-FU主要通过抑制胸苷酸合成酶(TYMS)来阻断DNA合成，从而发挥细胞毒性作用。有趣的是，生物信息学分析提示TYMS在胃癌组织中高表达，这可能与耐药有关。同时，研究人员通过数据库筛选发现，HDAC3在胃癌中表达升高，且与TYMS表达呈正相关。此外，肝细胞核因子4α(HNF4A)作为一个关键的胃癌相关癌基因，被预测能够结合TYMS的启动子区域。这些线索共同指向了一个潜在的表观遗传-转录调控轴可能参与调控TYMS表达和5-FU敏感性。本研究旨在系统阐述西达本胺是否通过调控HDAC3/HNF4A/TYMS轴来增强胃癌细胞对5-FU的化疗敏感性，相关成果发表在《Cell Death & Disease》杂志上。

为开展此项研究，研究人员运用了多种关键的实验技术方法。在细胞水平，研究使用了人胃癌细胞系（如MKN-45, HGC-27, NCI-N87）和正常胃黏膜上皮细胞GES-1进行体外实验。通过细胞计数 Kit-8(CCK-8)法和集落形成实验评估细胞活力和增殖能力。利用蛋白质印迹(Western blot)、实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、染色质免疫共沉淀(ChIP)、双荧光素酶报告基因实验、免疫共沉淀(Co-IP)和GST-pulldown等技术，深入探究了基因和蛋白的表达、转录调控、蛋白质相互作用及翻译后修饰。此外，还通过构建裸鼠皮下移植瘤模型进行了体内药效学验证，并采用免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)染色对肿瘤组织进行分析。

Chidamide enhances the sensitivity of gastric cancer cells to 5-FU

研究人员首先确认了西达本胺和5-FU对胃癌细胞的有效作用浓度。他们发现，西达本胺在浓度高于1μM时能抑制部分胃癌细胞活力，而5-FU则以浓度和时间依赖性的方式抑制细胞活力。联合用药实验表明，西达本胺能够增强胃癌细胞对5-FU的敏感性，计算出的零相互作用效力(ZIP) synergy score显示两药联合具有相加效应。通过筛查13个与5-FU药效学相关的基因，发现西达本胺能下调其中DPYS、TYMS和UNG的mRNA表达。进一步的生物信息学预测和实验验证将核心下游靶点锁定为TYMS。实验证实，TYMS在胃癌细胞中高表达，西达本胺和5-FU均可单独降低TYMS表达，而联合使用时效果更显著。这些结果初步表明西达本胺能够增强胃癌细胞对5-FU的敏感性。

Chidamide promotes the sensitivity of gastric cancer cells to 5-FU by downregulating TYMS

为了明确TYMS在其中的作用，研究人员通过短发夹RNA(shRNA)敲低了胃癌细胞中的TYMS表达。结果显示，TYMS敲低显著抑制了细胞活力和增殖，并增强了细胞对5-FU的敏感性。相反，过表达TYMS则促进了细胞活力和增殖，并降低了5-FU敏感性。重要的是，过表达TYMS能够逆转西达本胺对细胞行为的影响及其对5-FU的增敏作用。这表明西达本胺确实是通过下调TYMS表达来增强胃癌细胞对5-FU的响应。

Chidamide relieved the suppressive effect of HDAC3 on the sensitivity of gastric cancer cells to 5-FU

接下来，研究聚焦于西达本胺的直接靶点之一HDAC3。生存分析显示HDAC3高表达与胃癌患者不良预后相关。实验表明，西达本胺处理可降低HDAC3蛋白水平。敲低HDAC3能够下调TYMS表达，抑制细胞活力与增殖，并增强对5-FU的敏感性。而过表达HDAC3则产生相反效果，并能拮抗西达本胺的作用。这些结果说明HDAC3抑制了胃癌细胞对5-FU的敏感性，而西达本胺通过抑制HDAC3活性，解除了这种抑制效应。

The HDAC3/HNF4A complex regulates the transcriptional activity of TYMS

机制探索进一步深入。通过生物信息学工具预测并结合实验验证，研究人员发现转录因子HNF4A（其高表达同样与患者预后不良相关）与TYMS表达呈正相关，且能与HDAC3发生相互作用。Co-IP实验证实了HDAC3与HNF4A之间存在内源性和外源性结合。敲低HNF4A可降低TYMS表达。双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR实验证明，HDAC3和HNF4A能形成复合物，共同结合到TYMS启动子区域并调控其转录活性。值得注意的是，敲低HNF4A几乎完全消除了HDAC3与TYMS启动子的结合，而敲低HDAC3仅部分减弱了HNF4A的结合，提示HNF4A在此转录调控中扮演更核心的角色，HDAC3则作为辅因子发挥作用。

Phosphorylation of HNF4A at S313 promotes the expression of TYMS

为了阐明HDAC3/HNF4A复合物调控TYMS的具体分子细节，研究人员构建了HDAC3和HNF4A的多种截短体。GST-pulldown实验确定HNF4A的转录激活域(TAD)与HDAC3的脱乙酰酶激活域(DAD)相互结合。考虑到蛋白质翻译后修饰(PTMs)对转录因子功能的关键调控作用，研究人员检测了西达本胺处理后HNF4A的修饰变化，发现其乙酰化水平升高，磷酸化水平下降。通过位点突变筛选，他们发现HNF4A第313位丝氨酸(S313)的磷酸化对于其与HDAC3的结合至关重要。使用磷酸酶处理或蛋白激酶C抑制剂(PKCi)降低HNF4A磷酸化后，其与HDAC3的结合减弱。更重要的是，将S313突变为不能磷酸化的丙氨酸(S313A)后，HNF4A失去了激活TYMS转录和表达的能力。这表明HNF4A的S313位点磷酸化是促进TYMS表达的关键。

HDAC3 deacetylates HNF4A at K458, while chidamide enhances HNF4A acetylation at K458 and reduces phosphorylation at S313

那么，西达本胺和HDAC3是如何影响HNF4A磷酸化的呢？研究人员将目光投向了另一种重要的修饰——乙酰化。他们发现，敲低HDAC3或使用其特异性抑制剂RGFP966会增加HNF4A的乙酰化水平。通过位点分析，他们确定HNF4A第458位赖氨酸(K458)是一个关键的乙酰化位点。有趣的是，乙酰化与磷酸化之间存在交叉对话：引入K458R突变（模拟去乙酰化状态）反而增强了S313的磷酸化，并削弱了HNF4A与HDAC3的相互作用。相反，引入S313A突变（模拟去磷酸化状态）则增加了HNF4A的乙酰化。西达本胺处理显著增强了HNF4A在K458位点的乙酰化，同时降低了S313位点的磷酸化以及HDAC3-HNF4A复合物的形成。功能实验表明，HDAC3通过去乙酰化HNF4A的K458位点来调控其功能；而西达本胺通过抑制HDAC3，使HNF4A保持高乙酰化状态，进而抑制其S313位点的磷酸化，最终导致TYMS转录活性下降。进一步的机制探索表明，AMPK信号通路可能参与调控HNF4A的磷酸化，从而影响HDAC3的招募。

Chidamide suppresses the HDAC3/HNF4A/TYMS axis, thereby increasing the sensitivity of gastric cancer cells to 5-FU

为了整合上述发现，研究人员进行了挽救实验。在胃癌细胞中，同时过表达HDAC3和敲低TYMS。结果显示，敲低TYMS可以逆转由HDAC3过表达所引发的TYMS上调、细胞活力增强、增殖加速以及对5-FU的耐药性。西达本胺处理则能有效抑制这一轴线的活性。这充分证明了西达本胺是通过抑制HDAC3/HNF4A/TYMS信号轴来增强胃癌细胞对5-FU的敏感性。

Chidamide promotes the sensitivity of GC to 5-FU by inhibiting HDAC3/HNF4A/TYMS axis in vivo

最后，研究结果在动物模型中得到验证。在裸鼠移植瘤模型中，单独使用5-FU或西达本胺均能抑制肿瘤生长，而两药联合使用表现出更强的抑瘤效果。肿瘤组织分析显示，联合治疗组中增殖标志物Ki67、HDAC3和TYMS的表达水平显著降低。免疫荧光染色进一步证实，西达本胺处理减少了HDAC3和HNF4A在细胞核内的共定位，联合5-FU后此效应更明显。体内实验有力地支持了西达本胺通过抑制HDAC3/HNF4A/TYMS轴来增强5-FU抗胃癌效果的结论。

综上所述，本研究深入揭示了西达本胺增强胃癌对5-FU化疗敏感性的新机制。核心结论在于：西达本胺通过抑制HDAC3的活性，增加了其下游转录因子HNF4A在K458位点的乙酰化水平；这种乙酰化状态的改变，进而负向调控了HNF4A在S313位点的磷酸化修饰；HNF4A磷酸化的降低削弱了其转录激活能力，导致其靶基因TYMS的表达下调；TYMS作为5-FU的关键作用靶点，其表达下降最终使得胃癌细胞对5-FU的细胞毒性作用更为敏感。

这项研究的意义重大。首先，它在理论上阐明了一个全新的表观遗传调控通路——HDAC3/HNF4A/TYMS轴在胃癌5-FU耐药中的作用，深化了对化疗耐药机制的理解，特别是揭示了蛋白质乙酰化与磷酸化修饰之间的交叉对话在其中的关键桥梁作用。其次，在临床转化方面，该研究为西达本胺这一国产创新药物与经典化疗药5-FU的联合应用提供了坚实的理论依据和实验支持，为克服胃癌化疗耐药这一临床难题提供了有潜力的新策略。尽管本研究在细胞和动物模型上取得了令人鼓舞的结果，但作者也谨慎地指出，将其应用于临床仍需进行更深入的临床前研究和严格设计的临床试验，并需密切关注HDAC抑制剂可能带来的血液学毒性等副作用。未来研究可进一步探索此通路中其他环节的调控机制，以及在其他癌种中的普适性，为开发更有效的联合治疗方案开辟新的道路。