利用四面体框架核酸实现小分子激活RNA的生物可切换细胞内递送：在p21介导的抗肿瘤治疗中的应用

《Journal of Controlled Release》：Bioswitchable intracellular delivery of small activating RNA by tetrahedral framework nucleic acid: Application to p21-mediated anti-tumor therapy

本研究利用四聚体框架核酸（tFNA）作为生物开关可调载体，通过DNA/RNA杂交粘端高效负载p21-saR。内源性RNase H触发粘端剪切，实现saR动态释放及指导链筛选。体外和体内实验证实t-saR可有效诱导细胞衰老并抑制肿瘤生长，效果优于单体saR，为RNA激活疗法提供新策略。

　　

刘宇豪|林世宇|梁露露|蔡正文|庄伟杰|陈向毅|高乐川|李松航|林云峰

滨州医学院口腔医学院，中国烟台264003

摘要

小激活RNA（saR）因其独特的RNA激活功能而在生物医学领域受到了越来越多的关注。然而，作为一种短链双链寡核苷酸，saR的效果在很大程度上依赖于载体的递送效率以及saR的装载和释放的准确性和可靠性。四面体框架核酸已被证明是一种有效的寡核苷酸载体，但其在saR递送中的应用仍然有限。在本研究中，选择了p21-saR作为模型saR，该物质能够上调p21基因以诱导细胞衰老。p21-saR通过DNA/RNA杂交粘性末端被装载到四面体框架核酸（t-saR）上。在SCC-9细胞高效摄取后，t-saR在细胞内RNase H的作用下发生粘性末端剪切，从而实现saR的动态释放及其引导链的释放。通过靶向激活p21/Rb信号通路，t-saR在SCC-9细胞中促进了衰老并抑制了肿瘤生长，显示出比saR单体更优越的治疗效果。总之，这种可生物开关的t-saR能够有效实现RNA激活，在生物医学应用中具有巨大潜力。

引言

大多数基于RNA的药物通过下调目标基因表达来发挥治疗效果，例如小干扰RNA（siR）和微RNA（miR）[[1], [2], [3], [4]]。相比之下，小激活RNA（saR）具有“RNA激活”的独特功能[[5], [6], [7]]。双链saR在细胞内通过Ago2蛋白的介导被解旋，其引导链（G链）随后与Ago2结合并进入细胞核，靶向目标基因的启动子区域以上调其表达[5]。然而，由于缺乏特定的细胞膜受体，saR的细胞摄取效率较低[8]。此外，依赖于Ago2的机制要求saR在细胞质中保持自由状态并可与蛋白质结合。传统的递送载体通常缺乏在细胞内释放药物的明确时空模式，这影响了saR作用的可靠性和准确性。因此，saR的有效生物学效果在很大程度上取决于载体的递送效率以及药物装载和释放的精确性[5,9]。四面体框架核酸（tFNA）是一种三维纳米结构[[10], [11], [12], [13]]，已被证明是有效的寡核苷酸载体[[14], [15], [16]]。其核酸组成使其能够通过磷酸二酯键与RNA药物发生化学结合[[17], [18], [19]]。在初步研究中[20]，设计了一种基于粘性末端（SE）的DNA/RNA杂交链，用于将miR-2861装载到tFNA的顶点。细胞内的RNase H识别并切割了SE，导致miR释放，从而减少了载体对miR-靶标相互作用的干扰。与传统将miR直接连接到tFNA顶点的策略[21]相比，这种方法更准确地抑制了组蛋白去乙酰化酶-5的表达，并促进了干细胞的成骨分化。

RNase H在哺乳动物细胞中含量丰富，而saR和miR在序列长度和化学组成上具有相似性[22]。因此，假设tFNA也可以装载saR（t-saR），从而实现高效的细胞内递送和响应RNase H的释放，确保药物装载和释放的可靠性和准确性。

p21-saR被选为模型saR，是因为其具有明确的核酸序列，并且能够上调p21基因表达，促进细胞衰老和增殖停滞[[23], [24], [25], [26]]。利用体外和体内的口腔鳞状细胞癌模型，本研究验证了t-saR的作用机制和抗肿瘤效果，为基于saR的疗法的进一步应用和临床转化奠定了基础。

章节片段

t-saR的序列设计与合成

单链DNA（ssDNA）和双链p21-saR的序列列于表S1中（Sangon Biotech，上海，中国）。对于ssDNA，sS1-sS4的5′端被添加了SE。对于p21-saR，G链中的尿嘧啶和胞嘧啶核苷酸被修饰为2′-氟化物，以提高saR的稳定性。P链的3′端被添加了与sS1-sS4互补的SE，以确保特异性装载。P链的5′端还用Cy5进行了修饰，以便荧光检测。

t-saR的合成与表征

t-saR的合成示意图见图1a，相关核酸序列见表S1。四组含有或不含SE的ssDNA在同一锅中退火，合成s1tFNA/s4tFNA。这些混合物进一步与含有SE的saR孵育，从而得到装载有1个或4个saR的tFNA（包括t1-saR和t4-saR）。

使用8% PAGE分析（图1b）显示，合成产物的分子量逐渐增加，t4-saR的分子量最大。

结论

据我们所知，本研究是首次使用tFNA作为p21-saR的生物开关载体，如方案1所示。tFNA的主要优势在于它能够增强saR的细胞摄取，并在细胞内RNase H的作用下释放saR，确保其与Ago2蛋白的结合，从而实现有效的基因调控。此外，在所使用的浓度下，tFNA本身几乎不产生生物学效应，确保了基因靶向调控的精确性。

作者贡献声明

刘宇豪：正式分析、数据管理、概念构思。林世宇：数据管理。梁露露：正式分析。蔡正文：正式分析。庄伟杰：正式分析。陈向毅：正式分析。高乐川：数据管理。李松航：概念构思。林云峰：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响手稿的个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（82201027-->）、广东省自然科学基金（2024A1515011990-->）、山东省自然科学基金（ZR2025QC1658-->）以及四川省科技计划（2024NSFSC1591-->、2022ZYD0074-->）的支持。我们感谢Bullet Edits Limited在语言编辑和校对方面的帮助。