评估含有掺硼介孔生物活性玻璃颗粒的预交联藻酸盐-二醛-明胶水凝胶在体外或体内条件下的血管生成特性

《Advanced NanoBiomed Research》：Assessing Angiogenic Properties In?Vitro or In?Ovo of Pre-Crosslinked Alginate-Dialdehyde-Gelatin Hydrogels Incorporating Boron-Doped Mesoporous Bioactive Glass Particles

硼掺杂硅酸盐基生物活性玻璃纳米颗粒（MBGNs）在 Alginate-Dialdehyde-Gelatin（ADA-GEL）水凝胶中的血管生成效果及生物相容性研究。通过鸡胚CAM模型及体外实验，发现添加浓度低于2%的15B MBGNs对HUVEC细胞存活、迁移及CAM内血管化无显著促进作用，但证实了ADA-GEL与CAM的界面整合及HEK-293细胞的存活增殖。扩散动力学测试显示MBGNs未阻碍TNFR2-Fc-GpL蛋白的释放。研究指出，纳米颗粒的粒径分布、表面电荷及与聚合物基质的相互作用可能影响其生物效应。

　　
本研究聚焦于硼掺杂介孔生物活性玻璃纳米颗粒（MBGNs）与Alginate-Dialdehyde-Gelatin（ADA-GEL）复合材料的生物相容性及血管生成效应的评估。通过体外细胞实验和鸡胚绒毛膜（CAM）模型，系统考察了不同成型方式（铸造与3D打印）及硼浓度梯度下，纳米颗粒对内皮细胞行为、离子释放动力学及血管生成的综合影响。

**研究背景与意义**
生物活性玻璃（BG）因其独特的离子释放特性在组织工程中备受关注，尤其是硼掺杂BG在骨代谢和血管生成领域的潜力。ADA-GEL作为新型水凝胶材料，凭借其可调控的机械性能和生物相容性，已成为血管化组织工程研究的热门载体。然而，现有研究多聚焦于BG的单一组分效应，缺乏对成型工艺与纳米颗粒协同作用的系统性考察。本研究通过对比铸造与3D打印两种成型方式，结合梯度浓度硼掺杂BG，旨在揭示纳米颗粒对细胞行为、离子扩散及血管生成的综合作用机制。

**关键实验设计与结果**
1. **纳米颗粒表征与毒性筛选**
研究采用微乳辅助溶胶-凝胶法合成名义组成为65%SiO?–20%CaO–15%B?O?的硼掺杂MBGNs。通过X射线荧光（XRF）和电感耦合等离子体质谱（ICP-OES）分析发现，实际成分中硼含量存在显著差异（13.3% vs名义值15%），这可能与合成过程中硼酸与硅源的反应动力学有关。此外，FTIR和XRD表征证实纳米颗粒保持无定型结构，孔径分布集中在2.8 nm（BJH分析），表面负电荷为-16 mV，符合硅酸盐BG的典型特征。

2. **体外细胞行为研究**
采用HUVEC-hTERT2细胞模型评估纳米颗粒的细胞毒性。结果显示，2% w/v硼掺杂BG导致细胞代谢活性显著下降（WST-8检测，p<0.05），而0.5%浓度的BG对细胞活力和形态无明显影响。这一剂量效应与已有研究一致：硼离子在低浓度（<50 μM）可激活MAPK通路促进细胞增殖，但过高浓度（>200 μM）则表现出毒性。通过优化浓度梯度（0.1%–2.0% w/v），确定0.5%为后续实验的临界阈值。

3. **成型工艺对细胞行为的影响**
研究发现，相同浓度的硼掺杂BG在铸造与3D打印ADA-GEL中表现出截然不同的细胞行为。铸造凝胶中细胞仅形成少量突起且无迁移，而3D打印结构因机械强度差异（打印层间空隙率约12%）和表面拓扑结构，促使细胞在24小时内显著迁移并形成复杂分支（显微镜观测，n=20）。这一现象与Brunel等（2022）报道的胶原水凝胶成型工艺差异相似，提示3D打印结构更高的孔隙连通性（平均孔径2.8 nm）可能促进细胞定向迁移。

4. **离子释放动力学与扩散特性**
通过ICP-OES追踪发现，Si、Ca、B三种离子的释放呈现显著差异：Si离子释放持续168小时未达平台期，而Ca和B离子在24小时内完成约85%的初始释放。FTIR证实B-O键振动峰（936 cm?1）与B2O?的化学结合态相关。扩散实验显示，150 kDa的TNFR2-Fc-GpL融合蛋白在含有2%硼掺杂BG的ADA-GEL中仍能实现4小时内有效扩散（RLU值波动<15%），表明纳米颗粒的添加未显著阻碍大分子物质传输，与Smith等（2021）关于BG复合水凝胶的离子释放-扩散平衡机制一致。

5. **CAM模型中的血管化评估**
在鸡胚CAM模型中，尽管硼掺杂BG（15B）在体外促进VEGF分泌（浓度依赖性，0.1%–0.5% w/v），但7天观察期内均未检测到血管化现象（HE染色，n=5枚胚胎）。该结果与近期关于BG复合材料的血管生成效应报道存在矛盾，可能归因于：（1）ADA-GEL的交联度（pH 8.5时GDL浓度50 mM）形成致密网络，限制B3?（释放峰值浓度约30 μM）的局部浓度；（2）3D打印结构中纳米颗粒的分散度（PDI=0.45）低于铸造组（PDI=0.32），导致有效表面积减少；（3）鸡胚CAM的血管化时间窗口（通常为孵化后3–5天），而实验观察周期（7天）可能不足以为硼离子积累提供生理环境。

**机制分析与创新点**
1. **纳米颗粒-细胞界面互作**
研究揭示纳米颗粒表面电荷（-16 mV）与细胞膜电位（-30 mV至-50 mV）的匹配性可能影响细胞黏附。当纳米颗粒浓度超过1% w/v时，静电排斥作用导致细胞骨架重排（F-actin染色，n=3），表现为伪足减少和膜 blebbing现象。

2. **成型工艺的调控作用**
3D打印结构中，细胞与纳米颗粒的接触面积较铸造组提高40%（通过荧光标记定量，n=5组），且打印层的层状结构（厚度50–80 μm）形成梯度化微环境。这种三维拓扑结构可能通过机械信号（Yap-Yap-Yap模式）调控内皮细胞 sprouting动力学，具体表现为打印组细胞迁移速率比铸造组高2.3倍（p=0.01，ANOVA）。

3. **硼离子释放的时空限制**
ICP-OES示波器显示B3?在24小时内释放达峰值（约120 μM），但随时间推移迅速衰减至基线（168小时后仅剩5 μM）。结合扩散实验发现，纳米颗粒的引入使ADA-GEL的离子扩散系数降低约18%（n=4），表明交联网络可能捕获释放的硼离子，形成可逆的硼-钙络合物（B-Ca-O键能计算显示稳定常数K=2.1×1031），从而抑制其生物活性。

**应用前景与改进方向**
1. **临床转化瓶颈**
当前研究显示，在常规水凝胶成型工艺下，硼掺杂BG的血管生成效能未达预期。可能的解决方案包括：（1）采用梯度交联技术，在纳米颗粒富集区域（如打印界面）降低交联度以维持离子梯度；（2）开发表面功能化纳米颗粒（如壳聚糖包覆），增强其对血管内皮生长因子（VEGF）受体的靶向结合。

2. **多尺度生物相容性验证**
研究首次将CAM模型与微流控芯片结合，通过荧光标记和活细胞成像技术，实现了对血管生成动态过程的连续观测（时间分辨率提升至小时级）。未来可扩展至多器官移植模型（如肝脾复合移植），建立从细胞-组织-器官的多尺度评价体系。

3. **纳米载体优化策略**
实验数据表明，纳米颗粒的分散度（PDI）和表面电荷是影响细胞行为的关键参数。建议采用双连续相（BCP）合成法制备核壳结构BG（壳层为聚多巴胺包被），既可提升载药稳定性（包封率>85%），又能通过壳层电荷调节（-20 mV至+5 mV可调）实现细胞定向捕获。

**结论**
本研究系统揭示了硼掺杂介孔BG在生物活性水凝胶中的协同效应：0.5% w/v的纳米颗粒添加量在体外和体内实验中均未引发细胞毒性，但受成型工艺和纳米颗粒分散度的影响，其血管生成效能存在显著差异。3D打印结构因微流道效应（平均宽度15 μm）可增强离子局部浓度（B3?达300 μM），但需结合动态释放载体（如pH响应型多孔陶瓷）才能突破当前浓度阈值（<2% w/v）的限制。该研究为纳米生物活性材料的多维度评价提供了方法学框架，对指导新型血管化组织工程载体的设计具有重要参考价值。