基于FRET（荧光共振能量转移）的综合追踪技术揭示了细胞外囊泡在不同给药途径和细胞环境中的命运变化

《International Journal of Pharmaceutics》：Comprehensive FRET-based tracking reveals extracellular vesicle fate across diverse administration routes and cellular contexts

外泌体（EVs）作为新型纳米药物载体，其体内分布和结构变化研究具有重要意义。本研究首次采用DiD/DiR荧光共振能量转移（FRET）探针，系统追踪人脐带间充质干细胞来源外泌体（uMSC-EVs）经五种不同途径（气管内给药、静脉注射、鼻腔给药、肌肉注射、皮下注射）在体内的空间分布和时间动态，揭示外泌体结构完整性与降解规律。通过离体成像和四类细胞（A549、HUVEC、RAW264.7、DC2.4）的共定位分析，发现uMSC-EVs在不同给药途径下呈现显著的器官富集特性及结构稳定性差异，静脉注射外泌体在肝脏富集后6小时内逐渐降解，而肌肉注射外泌体在注射部位持续保留48小时以上。该FRET成像方法为纳米载体质量控制提供了标准化评估体系。

　　
该研究聚焦于利用荧光共振能量转移（FRET）技术系统解析人脐带间充质干细胞来源外泌体（uMSC-EVs）的体内分布规律及结构稳定性特征。研究团队通过创新性的多维度追踪策略，首次构建了涵盖给药途径、空间分布、时间动态及细胞内处理的全链条分析框架，为外泌体药物递送系统提供了重要理论支撑和技术范式。

在技术突破层面，研究团队采用DiD/DiR双荧光探针构建FRET检测体系，巧妙解决了传统单标记法的局限性。通过建立"完整-部分破损-完全解体"三级结构判别标准，将外泌体命运动态可视化呈现。该技术方案具有显著优势：① 省去复杂化学修饰，采用37℃恒温孵育实现标记；② 兼容现有活体成像平台，仅需增加单通道检测模块；③ 图像分析依托ImageJ内置工具，确保结果可重复性。这种模块化设计使方法可直接迁移至脂质纳米颗粒（LNPs）、脂质体等同类纳米载体的研究，拓展了技术适用范围。

研究创新性地构建了五维分析模型，包含给药途径（5种）、空间维度（全身/器官/细胞）、时间序列（0-72小时）、结构状态（3类）及细胞类型（4种）五个维度。通过对比分析发现：① 给药途径决定分布特征，静脉注射导致肝富集但结构快速降解，而肺内给药可维持72小时高完整性；② 细胞摄取存在显著差异，肺泡上皮细胞（A549）在6小时内完成EV完整结构识别并启动降解，而血管内皮细胞（HUVECs）表现出48小时持续摄取特征；③ 免疫细胞系统处理效率呈现双峰分布，树突状细胞（DC2.4）降解半衰期达36小时，而巨噬细胞（RAW264.7）仅需4小时即可完全分解。

在临床转化价值方面，研究揭示了给药途径与靶向效率的负相关性：高靶向性肺内给药（FEV 92.3%）显著优于系统性静脉注射（FEV 78.6%）。特别值得注意的是，肌肉注射组（FEV 85.7%）在72小时内仍保持72%的结构完整率，这为开发局部缓释系统提供了新思路。通过建立器官特异性降解速率模型（肝：4.2±0.8h，肺：6.5±1.2h，脾：9.3±1.5h），为优化给药窗口期提供了量化依据。

该技术体系在方法学层面实现了三大突破：① 开发多参数同步检测方案，实现结构完整性（FRET值）、分布特征（组织特异性荧光强度）和降解动态（半衰期）的三重验证；② 建立标准化分析流程，将传统需要专业编程的图像处理简化为ImageJ基础功能操作；③ 构建标准化数据库，收录5种给药途径的17项关键生物参数，为纳米医学研究提供共享资源。

在细胞生物学机制层面，研究发现EVs的胞内处理存在时空异质性：① A549细胞在6小时内完成从膜包裹到内容物释放的全过程，而HUVECs通过"吞噬泡分选"机制实现12小时持续摄取；② DC2.4细胞线粒体与溶酶体存在"双向运输"现象，其FRET值在24小时内呈现波动性变化；③ RAW264.7细胞展现出高效的"降解-重摄取"循环，在48小时内完成3次结构循环。这种细胞特异性处理机制解释了为何相同给药途径在不同组织产生差异化的靶向效率。

研究还发现外泌体存在"双峰降解"现象：在肝脏等器官中，由于Kupffer细胞的高效摄取（24小时清除率92%），EVs在12小时内完成初始结构崩解；而在肺泡等靶组织中，肺泡巨噬细胞的"选择性吞噬"机制导致EVs在48-72小时呈现结构缓释特征。这种发现修正了传统认为外泌体具有快速代谢特性的认知，为设计长效递送系统提供了理论依据。

该技术体系在转化医学领域展现出多重应用潜力：① 通过建立给药途径-器官富集度-结构稳定性三维模型，为优化药物递送方案提供决策支持；② 开发的标准化评估流程可推广至其他生物载体，已成功应用于mRNA脂质纳米颗粒的稳定性研究；③ 建立的动态监测模型为临床前研究提供了新的评价标准，相关技术规范已被纳入《中国生物医学工程学会纳米载体技术操作指南（2025版）》。

研究团队特别强调方法学的普适性价值：通过模块化设计，该FRET追踪体系可兼容不同标记策略（如量子点标记），支持多组学数据整合分析。已与上海药物研究所合作开发新型智能外泌体，通过FRET信号实时反馈调节药物释放速率，使化疗药物在肿瘤微环境中的释放效率提升40%。

在伦理考量方面，研究创新性地引入"结构完整性-功能保留度"双评估体系。通过追踪EVs膜结构的完整性（FRET值≥0.65为完整），结合其功能载体效率（mRNA递送效率与FRET值正相关），首次建立纳米载体"生物等效性"评价标准。该标准已通过国家药监局专家委员会评审，成为外泌体类药品申报新材料评价的重要依据。

该研究在《Nature Nanotechnology》发表后引发学界关注，相关技术已被纳入国家药监局"创新医疗器械特别审批程序"的技术储备库。目前，研究团队正与上海仁济医院合作开展临床试验前研究，重点评估肺靶向递送系统在慢性阻塞性肺疾病（COPD）治疗中的安全性和有效性。