健康受试者中IL-5抑制剂生物制剂反应的血浆生物标志物的蛋白质组学鉴定

《Clinical and Translational Science》：Proteomic Identification of Plasma Biomarkers of Response to IL-5 Inhibitor Biologics in Healthy Subjects

蛋白质组学方法分析健康受试者接受IL-5抑制剂mepolizumab和resлизumab治疗后血浆蛋白变化，发现嗜酸性粒细胞主要基础蛋白（EMBP）和聚糖-3（PRG3）作为潜在药效学生物标志物，分别对两种抑制剂响应，具有剂量依赖性和时间动态特征，并通过剂量验证和通路分析确认其可靠性。

　　
### IL-5抑制剂药效学（PD）生物标志物的发现与验证
#### 研究背景与意义
interleukin-5（IL-5）是嗜酸性粒细胞活化的关键调控因子，其抑制剂（如mepolizumab和resлизumab）已被批准用于嗜酸性粒细胞型哮喘的治疗。然而，现有临床评价主要依赖血液嗜酸性粒细胞计数（BEC），存在以下局限性：
1. **BEC的动态波动**：嗜酸性粒细胞在血液中半衰期较短（约8-18小时），且易迁移至肺、肝等组织，导致外周血检测难以准确反映气道内炎症状态。
2. **功能性盲区**：BEC无法表征嗜酸性粒细胞激活状态或炎症介质的释放水平，而IL-5抑制剂的作用机制涉及抑制嗜酸性粒细胞脱颗粒和炎症介质的产生。
3. **生物类似物开发需求**：在生物类似药研发中，传统体外实验（如体外抑制活性）成本高且周期长，亟需快速、高通量的体内生物标志物来评估制剂等效性。

基于上述问题，该研究通过血浆蛋白质组学技术，系统性筛选IL-5抑制剂在健康人群中的药效学生物标志物，旨在为剂量优化、疗效预测及生物类似物评价提供新工具。

#### 研究方法与创新点
1. **技术平台与样本设计**
- 采用SomaScan v4.1平台，同时检测超过7000种血浆蛋白的相对荧光单位（RFU），覆盖细胞外基质、炎症因子、代谢酶等关键功能类别。
- 样本来源于FDA批准的临床研究（NCT04183192），选取高剂量组（mepolizumab 24mg，resлизumab 0.8mg/kg）和低剂量组（mepolizumab 12mg，resлизumab 0.4mg/kg）的血浆样本，通过纵向追踪（0-123天）评估时间动态变化。
- **创新方法**：结合剂量响应分析（Jonckheere-Terpstra检验）、效应曲线下面积（AUEC）和可重复性验证，确保候选标志物的可靠性。

2. **生物标志物筛选标准**
- **统计学显著性**：使用线性混合效应模型校正多重比较（Bonferroni校正阈值p<6.86E-06），排除随机噪声干扰。
- **剂量依赖性**：候选标志物需在高低剂量组均显示响应，且响应强度与药物剂量呈正相关（通过非参数检验验证趋势）。
- **可重复性**：低剂量组（12mg mepolizumab，0.4mg/kg resлизумаб）的响应需与高剂量组一致，排除剂量过高的假阳性结果。

#### 关键发现与机制解析
1. **核心生物标志物识别**
- **EMBP（嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白）**：与mepolizumab显著相关（p=8.66E-07），表现为血浆中↓26%的 fold change（峰值出现在第28天），且在低剂量组（12mg）同样检测到响应（p=3.09E-06）。
- **PRG3（聚糖-3）**：与resлизумab强关联（p=1.13E-06），血浆水平在第28天达到峰值（↓28%），并在低剂量组（0.4mg/kg）中仍保持显著响应（p=1.25E-05）。
- **其他共响应蛋白**：包括C4a（补体系统激活标志）、CA130（细胞骨架相关）、NRX3B（神经递质调控），提示IL-5抑制剂可能通过多靶点途径调控免疫应答。

2. **药效学特征分析**
- **时间动态**：EMBP和PRG3的响应峰值滞后于药物给药时间（21-28天），可能与炎症介质清除和细胞内信号转导延迟相关。
- **剂量-效应关系**：mepolizumab 12mg组和resлизумab 0.4mg/kg组均观察到标志物水平与剂量呈正相关（JT检验p<0.05），验证了候选标志物的敏感性。
- **可变性与稳定性**：EMBP的个体间变异系数（CV）较高（约12%），可能受样本采集时间或个体差异影响；PRG3的CV（8%）更接近对照组（9%），提示其作为稳定生物标志物的潜力。

3. **功能网络与机制关联**
- **上游调控网络**：通过 upstream regulatory analysis（URA）发现，IL-5抑制剂通过抑制NF-κB和MAPK信号通路间接调控EMBP和PRG3表达。
- **相互作用网络**：STRING分析显示，EMBP与PAPP-A（胰岛素样生长因子结合蛋白4）形成复合物（置信度0.99），而PRG3与IL-5存在直接相互作用（置信度0.6），提示两者可能通过不同的下游通路影响嗜酸性粒细胞功能。
- **与已知标志物的对比**：与Asamoah团队发现的PAPP-A（最初误标为EMBP）相比，本研究明确区分了EMBP（seq.4148.49）与PAPP-A（未在SomaScan v4.1中覆盖），并验证了PRG3作为新型生物标志物的特异性。

#### 临床转化价值与局限性
1. **应用场景**
- **剂量优化**：在健康志愿者模型中，低剂量（12mg mepolizumab，0.4mg/kg resлизумаб）即可触发标志物响应，为确定临床前剂量提供依据。
- **生物类似物评价**：PRG3和EMBP可作为IL-5抑制剂生物类似物的生物等效性替代终点（BALT），减少长期重复给药的伦理与经济负担。
- **个性化治疗**：结合标志物动态变化（如EMBP在28天达峰），可指导分阶段给药或联合疗法设计。

2. **局限性及改进方向**
- **人群特异性**：研究基于健康志愿者，未来需在哮喘患者中验证标志物与临床疗效（如FEV1改善率、炎症介质下降幅度）的关联性。
- **技术干扰因素**：SomaScan平台对低丰度蛋白检测灵敏度有限（如检测下限为RFU 100），可能遗漏部分生物标志物。建议结合质谱技术（如Orbitrap）进行互补验证。
- **时间跨度不足**：研究周期为123天，未能覆盖药物长期停药后的反弹效应，需延长随访时间以评估标志物的持久性。

#### 未来研究方向
1. **多组学整合分析**：结合单细胞测序（解析嗜酸性粒细胞亚群变化）和代谢组学（评估炎症介质如IL-5、IL-13、IL-33的动态），明确EMBP和PRG3的调控机制。
2. **生物标志物组合优化**：探索EMBP与PRG3的组合检测，通过主成分分析（PCA）区分不同哮喘亚型（如嗜酸性粒细胞增多型与中性粒细胞增多型）。
3. **技术平台升级**：采用更高灵敏度的蛋白质组学平台（如TMT-MS/MS）检测更低丰度的靶标（如IL-5本身），完善药物浓度-效应关系模型。

#### 总结
本研究首次利用高灵敏度血浆蛋白质组学技术，系统筛选出IL-5抑制剂（mepolizumab和resлизumab）的药效学生物标志物EMBP和PRG3。通过剂量响应验证和功能网络分析，揭示了两者在嗜酸性粒细胞活化通路中的关键作用，为生物类似物开发提供了新的评价工具。尽管在患者群体验证和长期效应分析上存在局限，但该成果为靶向炎症介质（如IL-5）的药物开发建立了可量化的技术框架，可能推动精准呼吸病学进入临床实践阶段。