寻找新型抗病毒药物作为COVID-19的治疗方法：胍基二苯硫脲类化合物

《ChemMedChem》：Searching for Novel Antiviral Agents as COVID19 Treatments: Guanidino Diaryl Thioureas

病毒通过TMPRSS2进入宿主细胞，针对该酶的可逆抑制剂筛选出候选化合物1。通过计算结构生物学和分子动力学模拟优化25种衍生物，但未提升抑制活性。与已知的不可逆抑制剂nafamostat和camostat相比，可逆抑制机制效率不足。研究建议开发不可逆TMPRSS2抑制剂以增强抗新冠病毒效果。

　　
### 研究背景与意义
COVID-19大流行凸显了开发新型抗病毒治疗策略的紧迫性。尽管目前已有三种针对病毒蛋白酶或RNA聚合酶的抗病毒药物获批，但存在耐药性风险高、全身给药难以达到靶器官有效浓度等问题。因此，探索新的抗病毒靶点成为研究热点。SARS-CoV-2的细胞进入依赖两种关键蛋白酶： TMPRSS2（跨膜丝氨酸蛋白酶）和猫hepsin L。其中，TMPRSS2在早期病毒扩散中起核心作用，尤其是针对原始毒株和奥密克戎之前的变体。然而，针对TMPRSS2的可逆抑制剂（如早期发现的化合物1）在后续优化中未能显著提升活性，这提示可能存在机制上的局限性。本研究通过结构优化和分子模拟，系统评估了可逆硫脲类化合物的潜力，并揭示了其与不可逆抑制剂的差异。

### 研究方法与流程
#### 1. 结构设计与计算筛选
研究团队基于前期发现的“hit-compound”（化合物1）的活性，设计并合成了25个衍生物。通过同源建模和X射线结构解析，构建了TMPRSS2的3D结构（PDB:7MEQ），发现其活性位点包含关键残基Q438、H296和S441。利用虚拟筛选工具（Autodock Vina）和诱导契合对接（IFD）技术，评估了化合物与酶的相互作用。计算显示，衍生物在结合口袋的疏水区域和催化三联体附近具有类似化合物的构象，但未发现活性优于化合物1的候选物。

#### 2. 分子动力学模拟与稳定性分析
对化合物1进行200纳秒的分子动力学模拟，验证其与TMPRSS2的结合稳定性。结果显示，化合物1与靶点蛋白的相互作用网络（氢键、离子键、疏水作用）在动态过程中保持稳定，未出现显著构象偏移。进一步的热力学分析表明，疏水相互作用（占结合能的60%以上）和酸性残基（Asp432、Glu299）与guanidinium正电中心的盐桥是主要驱动力。

#### 3. 药代动力学（ADME）评估
通过SwissADME工具分析化合物的理化性质，发现所有衍生物均符合“五规则”的药物可及性标准（分子量<500 Da，logP<5，氢键供体/受体数合理）。其中，化合物8因含有PAINS（非特异性亲核陷阱）结构被排除，其余化合物未显示显著毒性。

#### 4. 合成路线与化合物制备
采用“Boc-保护”策略合成二芳基硫脲类化合物。首先通过点击化学将Boc-保护的氨基苯基连接到硫脲框架上，再通过酸性脱保护释放活性化合物。此方法已在本团队前期工作中验证，适用于高纯度合成（产率>85%）。

#### 5. 生化活性验证
通过伪病毒感染实验评估化合物抑制病毒进入的效果：
- **Calu-3细胞模型**（依赖TMPRSS2的病毒进入）：化合物1的半抑制浓度（IC50）为150 nM，而衍生物未改善活性。
- **Vero76细胞模型**（依赖猫hepsin L的病毒进入）：所有化合物均无效，验证了其特异性针对TMPRSS2。
- **药效学对照**： camostat（IC50=142 nM）和nafamostat（IC50=55 nM）在细胞模型中表现出显著抑制活性，但临床转化受限于给药途径。

### 关键发现与机制解析
#### 1. 可逆抑制剂的局限性
尽管化合物1通过可逆结合显示活性，但其衍生物未能提升抑制效果。计算显示，可逆结合依赖于两个guanidinium基团与Asp432的氢键和盐桥。然而，这类结合方式无法像不可逆抑制剂（如nafamostat）那样形成共价键，导致抑制效率受限。分子动力学模拟进一步证实，可逆结合的化合物在模拟过程中仅维持弱相互作用（结合自由能约-61.5 kcal/mol），而不可逆抑制剂通过共价修饰可稳定结合（自由能约-80 kcal/mol）。

#### 2. 结构优化的瓶颈
研究团队尝试通过调整芳香环取代基（如引入苯环或萘环）、改变硫脲链的极性等策略优化活性。但实验发现，尽管部分衍生物（如化合物18）的logP值更接近脂溶性靶标（logP=3.56），但其抑制活性仍无提升。这可能源于疏水区域的空间位阻，或电荷分布对关键残基的微环境改变。例如，化合物18的疏水尾端因体积过大无法有效接触H296残基的芳香环口袋。

#### 3. DNA结合与细胞毒性的关联性
前期研究表明，硫脲类化合物可能通过DNA结合发挥毒性。本研究通过紫外热变性实验发现，化合物1与DNA结合的熔解温度（ΔTm）为23.0°C，而衍生物2和20的ΔTm分别为0.65°C和-0.25°C，表明多数衍生物不具备显著DNA结合能力。细胞毒性测试显示，化合物2在100 μM浓度下仍维持>90%的细胞存活率，证实其选择性靶向TMPRSS2而非泛素化抑制。

### 讨论与未来方向
#### 1. 可逆与不可逆抑制的差异
不可逆抑制剂（如nafamostat）通过共价结合丝氨酸残基的羟基，彻底阻断蛋白酶活性。而可逆抑制剂（如化合物1）需频繁解离-再结合，尤其在体内环境动态变化下（pH波动、酶浓度变化），可能导致抑制效率不足。此发现呼应了2021年 resolved crystal structure（PDB:7MEQ）揭示的nafamostat共价结合机制，为TMPRSS2抑制剂设计提供了重要启示。

#### 2. 结构优化策略的调整
基于上述结果，研究提出以下改进方向：
- **引入共价结合基团**：在硫脲链中嵌入亲核基团（如磺酸酯），在体外模拟共价结合，并验证其体内稳定性。
- **靶向催化三联体**：优化guanidinium基团的空间取向，增强对Asp432和Glu299的静电互补作用。例如，化合物1的guanidinium与Asp432形成稳定的盐桥（pKa=3.0 vs. HCl pKa=7.0），而衍生物2的甲基取代可能破坏这一关键相互作用。
- **多靶点协同抑制**：结合TMPRSS2与病毒S蛋白的其他结合位点（如RBD区域），设计双功能抑制剂。

#### 3. 临床转化挑战与对策
- **给药途径优化**：如氯喹通过调节内体pH抑制猫hepsin L，提示外用给药（吸入或鼻腔给药）可能更适合肺泡局部抑制TMPRSS2。
- **耐药性监测**：需持续评估奥密克戎等变体对TMPRSS2酶活性的影响，例如其S蛋白的S2'剪切位点的氨基酸突变（如G614D）可能降低可逆抑制剂活性。
- **联合疗法开发**：与RNA聚合酶抑制剂（如瑞德西韦）联用，可协同阻断病毒复制周期。

### 结论
本研究揭示了可逆硫脲类TMPRSS2抑制剂的局限性，并验证了不可逆抑制机制在临床应用中的必要性。未来研究应聚焦于：
1. **共价抑制剂开发**：通过结构设计实现共价结合，如引入α-氟代苯环或炔烃基团，增强与酶活性位点的不可逆结合。
2. **精准给药系统**：结合脂质纳米颗粒（LNP）或阳离子聚合物，实现肺泡靶向递送，避免全身毒性。
3. **多组学验证**：利用类器官模型（如肺泡上皮细胞3D球体）和单细胞测序，解析抑制剂对病毒跨膜融合的动态影响。

该研究为TMPRSS2靶向药物提供了重要理论依据，并推动了从“可逆”到“不可逆”抑制策略的范式转变，为下一代抗COVID-19药物研发指明方向。