一种新型的反相高效液相色谱方法，用于同时分析酒石酸溴莫尼定和马来酸噻吗洛尔，以评估其稳定性

《Frontiers in Chemistry》：A novel reversed phase high performance liquid chromatography approach for stability-indicating simultaneous analysis of brimonidine tartrate and timolol maleate

本研究开发了并验证了一种反相色谱高效液相色谱法（RP-HPLC），用于同时测定眼科制剂Combigan?中Brimonidine Tartrate和Timolol Maleate，满足ICH和FDA标准。方法表现出高灵敏度（LOD 0.08-0.20 ppm）、精密度（RSD<2%）和特异性，通过稳定性测试确认Brimonidine在热、光及酸碱条件稳定，而Timolol对氧化和强酸碱敏感。绿色化学评估显示方法具有中等环保性（Eco-Scale≈75）。该法为Combigan?的质量控制和稳定性研究提供了可靠工具。

　　
本文针对眼科制剂Combigan?中Brimonidine Tartrate（BT）和Timolol Maleate（TM）的同步定量分析需求，系统阐述了新型RP-HPLC方法的开发与验证过程，重点探讨了其在稳定性评估、绿色化学特性及临床应用中的优势。研究首先基于现有文献分析，指出传统分析方法存在线性范围狭窄（如BT仅4-24 μg/mL）、缺乏稳定性指示功能（如未进行强制降解实验）等局限性，这为新型方法的研发提供了明确的技术缺口。方法开发阶段采用多维度优化策略，包括色谱柱筛选（对比5种C18柱）、流动相pH调控（从2.9至7.0梯度测试）、检测波长优化（245 nm和295 nm双波长协同检测）等关键步骤，最终确定Supelco Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）与80:20（pH 7.0磷酸缓冲液：乙腈）流动相组合，实现BT（保留时间约5.8分钟）与TM（约8.8分钟）的基线分离，同时满足降解产物检测需求。

在方法验证环节，研究构建了覆盖200-500 ppm（BT）和250-1250 ppm（TM）的宽泛线性范围，相关系数均达0.999以上，特别通过稀释法拓展了BT的检测下限至0.24 ppm，TM至0.60 ppm。方法展现出卓越的稳健性，在pH波动±0.2、流速偏差±0.2 mL/min等常见操作变异下，保留时间相对标准偏差（%RSD）均低于1%，理论塔板数稳定在9000以上，有效克服了传统方法因条件波动导致的重复性问题。

稳定性研究采用加速老化试验（75℃/85%湿度）和光照实验（245 nm/295 nm紫外灯照射），发现BT在湿热环境下保持0.04%日降解率，而TM在光照下日降解率不超过0.5%。值得注意的是，TM对氧化性环境尤为敏感，3% H?O?处理24小时后降解率达57%，这与其化学结构中易被氧化的噻二唑环密切相关。研究创新性地引入混合降解体系（酸、碱、氧化联合处理），通过三重色谱峰解析技术（保留时间、紫外光谱、质谱辅助判别），成功将BT与TM的降解产物（如酸水解产生的男离子酸）分离度提升至2.5以上，显著优于传统方法（分离度<1.8）。

在绿色化学实践方面，采用Eco-Scale量化评估体系显示，该方法在溶剂消耗（仅20%乙腈）、设备能耗（10分钟内完成分析）和废弃物排放（减少40%有机溶剂使用）三个维度得分优于85%，但存在乙腈回收率不足（仅35%）的改进空间。GAPI评估指出，虽然未采用生物降解溶剂（如乙醇替代乙腈），但通过缩短分析周期（较传统方法快30%）和简化前处理步骤（无需固相萃取），仍达到中等绿色水平（GAPI评分0.68/1.0）。AGREE工具评估显示，在操作安全（乙腈毒理风险）、废物处理（直接排放）、仪器维护（HPLC系统故障率降低60%）等关键指标上需加强改进。

临床应用验证部分，通过对比Combigan?原研药与仿制药的定量分析数据，发现该方法在200 ppm浓度下的相对标准偏差（RSD）仅为0.51%，显著优于国际药典要求的2.0%标准。特别在检测复杂基质（如含防腐剂的眼药水）时，通过优化流动相pH至7.0，成功抑制硅烷基质效应，使检测灵敏度提升3倍。稳定性跟踪显示，在4℃避光储存条件下，BT和TM的降解率分别控制在0.15%和0.38%/年，符合USP<611>对多组分制剂的稳定性要求。

该研究填补了现有文献中关于固定复方制剂稳定性评价方法的空白，其创新点体现在：1）开发双波长检测系统，同时降低BT（最大吸收245 nm）和TM（295 nm）的检测限至0.08 ppm和0.20 ppm；2）建立包含5种降解路径（酸/碱水解、氧化、热、光、机械剪切）的复合降解模型，准确率高达98.7%；3）引入环境成本评估矩阵，量化方法中乙腈消耗（12.5 mL/次分析）、包装材料（减少30%一次性塑料使用）等12项环境指标。

对于制药企业而言，该方法可显著降低质量控制成本：单批次分析时间从传统方法的45分钟缩短至28分钟，设备维护周期延长2倍，同时通过精确的降解动力学模型（半衰期预测误差<5%），可指导优化生产工艺参数。临床数据表明，该方法在30个不同批次的眼药水检测中，回收率稳定在98.2%-101.5%，RSD值始终低于1.2%，为药品上市许可持有人（MAH）提供了可靠的合规性证明工具。

未来改进方向建议：1）开发梯度洗脱程序以提升分离度，特别针对BT与TM的降解产物（如男离子酸和甲磺酸盐）；2）建立溶剂循环系统，将乙腈回收率从35%提升至70%以上；3）整合近红外光谱（NIRS）技术，实现非破坏性在线监测。这些改进有望将AGREE评分从当前的0.57提升至0.85，达到国际领先水平。

本研究为眼科药物的质量控制提供了标准化解决方案，其核心价值在于通过精准的化学分离与表征技术，确保复方制剂在复杂药代动力学环境下仍能维持 therapeutic equivalence（治疗等效性）。特别在多组分药物稳定性评估方面，提出的"三重验证法"（色谱峰纯度、降解动力学、环境成本）已成为行业新标杆，相关技术指标已被纳入《中国药品质量标准》2025版修订草案。