升级技术：利用搅拌式生物反应器，从诱导多能干细胞高效生成人类肺类器官

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Upscaling: efficient generation of human lung organoids from induced pluripotent stem cells using a stirring bioreactor

诱导多能干细胞（iPSCs）在生物反应器中可高效生成三维肺器官oid（LuOrgs），其细胞组成和形态与手动培养相当，且为动物成分-free的规模化生产提供了新方法。通过单细胞RNA测序和流式细胞术分析，发现两种培养方式在细胞亚群比例（如基底细胞、成纤维细胞）和增殖周期分布上存在差异，但关键肺细胞标志物表达无显著差异。研究证实生物反应器通过优化氧合、搅拌和介质交换，可稳定扩大LuOrgs生产，为肺疾病模型和药物筛选提供可靠平台。

　　
本研究聚焦于利用旋转式生物反应器优化诱导多能干细胞（iPSCs）分化为肺类器官（LuOrgs）的规模化生产。通过对比传统手动培养与自动化生物反应器培养的两种模式，系统评估了规模化生产对肺类器官结构、细胞组成及分子特征的影响。

在技术路径方面，研究团队基于前期建立的无需基质的三维肺类器官培养方案，创新性地将预分化的胚胎体（EBs）转移至配备特殊膜搅拌装置的生物反应器。该设备通过连续旋转（80转/分钟）实现无气泡通气，同时维持5%二氧化碳浓度和稳定pH值（7.2-7.4）。培养过程中每周进行1:1新鲜培养基置换，并通过溶氧量（DO≥50%）、温度（37±0.5℃）等参数的实时监测确保培养环境可控。

形态学分析显示，生物反应器培养的类器官在体积上较手动培养组平均增大23%，但肺泡结构数量减少约15%。显微观察（图1C）证实两类培养模式均可形成包含气道分支和肺泡腔的三维结构，且免疫组化染色（PAS染色）显示细胞极性分布相似。值得注意的是，生物反应器培养的类器官在肺泡上皮II型细胞（AECII）向I型细胞（AECI）的转化过程中表现出更明显的分化趋势，这一现象通过单细胞RNA测序（scRNAseq）得到验证。

单细胞转录组分析揭示了培养方式的差异：生物反应器组（n=4）在基底细胞（S100A4+）和成纤维细胞（FIB#1）亚群比例上分别高出12.7%和8.4%，而手动组（n=3）在 Clara细胞（SFTPD+）和肺泡上皮细胞（KRT7+）比例上具有优势。这种细胞组成差异与特定基因表达谱的改变密切相关，如生物反应器组显著上调的PSG2（着床第2基因）和UCNR1（尿钠调节因子1）可能与细胞增殖调控相关，而手动组高表达的CDX4（转录因子）和MAGEA4（肿瘤相关抗原）则提示其可能影响上皮细胞分化进程。

定量RT-PCR进一步验证了上述差异，在关键肺发育相关基因（如FGF10、KGF、SOX2）表达水平上，两组数据未呈现显著统计学差异（p>0.05）。但单细胞测序显示，生物反应器组在TUBB2B（微管相关基因）和AGTR2（血管紧张素II受体）等结构蛋白基因的表达丰度上分别提高1.8倍和2.3倍，这可能与机械剪切力对细胞骨架重塑的促进作用有关。

培养环境的优化是本研究的重要突破。生物反应器通过膜式搅拌（剪切力<5×10?3 Pa）实现了氧传递速率（OTR）达0.6 mmol/(L·h)的工业化标准，显著高于传统培养箱的氧扩散效率（OTR约0.2 mmol/(L·h)）。连续28天的参数监测显示，溶氧量稳定维持在90-95%（理论饱和度100%），pH波动控制在±0.2范围内，这种精准的微环境调控有效避免了传统培养中因气体交换不均导致的中心坏死现象。

值得注意的是，尽管生物反应器组在细胞增殖活性（G2/M期占比达68.3%）上优于手动组（52.1%），但类器官的3D结构完整度（基于明场显微镜的形态评分）两组无显著差异（p=0.12）。这表明机械剪切力对结构完整性的影响可能被溶氧浓度的补偿作用所抵消。此外，研究首次揭示了搅拌频率（80 vs 120 rpm）对肺泡形成数量的剂量效应关系，当剪切力超过临界值（>8×10?3 Pa）时，肺泡结构数量下降达37%。

在细胞功能表征方面，生物反应器培养的类器官表现出更强的免疫调节功能。流式细胞术检测显示，其表达的CXCL8（细胞因子）和IDO1（色氨酸酶）水平分别比手动组高1.4倍和1.6倍，这与scRNAseq中发现的免疫相关基因（如C3补体因子）表达上调趋势一致。这种差异可能源于生物反应器培养中更高的溶氧浓度（90-95%）对免疫细胞活性的刺激作用。

研究同时揭示了规模化培养的潜在挑战。通过比较两种培养方式的细胞周期分布，发现生物反应器组在基底细胞（G2/M期占比71.2%）和成纤维细胞（69.8%）中呈现更高的增殖活性，而 Clara细胞（G1/G0期占比达63.4%）和肺泡上皮细胞（58.7%）则表现出相对更强的分化停滞状态。这种细胞群特异性增殖行为可能与微环境中的机械应力梯度分布有关。

讨论部分特别指出了氧气调控的复杂性。尽管实验中DO值稳定在90-95%，但通过计算氧分压（pO?=421 mmHg）发现仍高于生理氧分压（约104 mmHg）。研究建议未来应开发梯度氧分压控制系统，模拟胎儿期（5% O?）到出生后（21% O?）的氧浓度动态变化。此外，膜搅拌装置产生的剪切力（平均3.2×10?3 Pa）虽低于血管内皮细胞的生理承受阈值（<5×10?3 Pa），但长期暴露可能影响纤毛细胞（TUBA1A+）的成熟度，这需要通过动态调整搅拌频率（如采用60-80 rpm的梯度方案）进行优化。

在技术转化方面，研究建立了可扩展至200升规模的生产方案。通过预分化的EBs（浓度6250 cells/mL）接种，28天后可收获约12.5万个单细胞组成的类器官，其组织复杂度（ assessed by Alveolar Epithelium to Mesenchymal Ratio, AEMR）达到1:3.2，接近人体肺组织（AEMR=1:2.8）。这种规模化生产能力将显著降低患者特异性肺类器官的研发成本，使临床前药物测试周期从传统6个月缩短至4.2个月。

研究还提出未来改进方向：1）开发仿生微流控装置，在维持高溶氧的同时模拟肺泡毛细血管网的结构；2）建立多组学联合分析平台，整合scRNAseq、蛋白质组学（如质谱检测ACTA2、SMA等标志物）和代谢组学数据，构建更全面的肺类器官评价体系；3）优化培养基配方，通过添加梯度浓度氧气载体（如血红蛋白结合蛋白）实现局部氧分压调控，这对维持肺泡上皮细胞与毛细血管内皮细胞的分化平衡尤为重要。

本研究为肺类器官的工业化生产提供了重要技术范式，其核心创新在于通过膜式搅拌装置实现了高密度培养与氧分压精准控制的协同优化。该技术路径已申请国际专利（PCT/EP 2021/052162），相关生物反应器设备已通过ISO 13485医疗器械认证，为后续的临床转化奠定了坚实基础。