通过冷冻电镜技术揭示了细菌光敏色素中别构作用和非对称变暗过程的化学机制

《Journal of the American Chemical Society》：Chemical Mechanism of Allosteric and Asymmetric Dark Reversion in a Bacterial Phytochrome Uncovered by Cryo-EM

光敏色素PaBphP在黑暗逆转中形成PrPfr杂合体，仅B亚基发生构象变化并完成胆绿素异构化，A亚基因H277与D环氧基直接氢键被锁定。研究发现PAS-GAF二聚体接口的几何构型（I/II型）影响H277氢键模式，进而调控黑暗逆转速率，pH依赖实验证实H277质子化状态对异构化起关键作用。

　　
光敏色素PaBphP的暗重排机制研究揭示了结构不对称性与动态调控的协同作用，为光遗传学工具开发提供了新见解。该研究通过单粒子冷冻电镜技术捕捉到黑暗重排过程中的关键中间态——PrPfr杂合体，并发现其转化过程具有显著的不对称性。实验表明，在PrPr同源二聚体中，仅一个亚基（B亚基）能通过构象调整完成暗重排，而A亚基的构象稳定抑制了这一反应。这种不对称性源于PAS-GAF结构域二聚接口的构象差异，导致两个亚基的动态环境不同。

在PAS-GAF二聚体中，两种几何构象交替存在：几何I（开放型）中GAF_A与PAS_B形成松散连接，而几何II（封闭型）则通过螺旋A的刚性排列强化界面。这种构象差异直接影响亚基B的暗重排能力，使其成为主导反应的亚基。冷冻电镜密度分析发现，B亚基的叶绿素配体周围存在更灵活的空间环境，而A亚基的H277组氨酸与D环羰基氧形成直接氢键，这种化学相互作用显著抑制了暗重排反应。

研究进一步揭示H277组氨酸在调控中起关键作用。在PrPr状态下，A亚基的H277通过直接氢键与D环羰基氧结合，稳定酮式结构并阻碍异构化；而B亚基的H277则更倾向于与C环丙酸基团通过水分子间接作用，这种构象差异使B亚基更易发生热异构化。分子动力学模拟显示，两种氢键模式在亚基间动态切换，且切换频率与暗重排速率呈正相关。当H277脱离D环直接结合时，叶绿素配体更易从酮式转变为烯醇式，触发暗重排反应。

pH依赖性实验验证了组氨酸的质子化状态对反应速率的影响。当pH升高至7.9时，H277的质子化程度降低，削弱其与D环的氢键作用，导致暗重排速率显著提升。这种pH敏感性表明，H277的质子化状态可能通过调节配体-溶剂接触网络影响异构化过渡态的稳定性。

该研究首次在细菌光敏色素中明确证实PrPfr杂合体作为暗重排中间态的存在，并建立了"结构不对称-动态调控"的双层控制机制。首先，PAS-GAF二聚体接口的构象差异（几何I/II）通过改变H277的空间可及性，使其在A亚基形成稳定氢键，而在B亚基无法有效结合。其次，动态平衡中B亚基的H277更易脱离配体，通过水分子网络实现过渡态稳定。这种双重调控机制不仅解释了暗重排速率的物种差异，还为光遗传学工具设计提供了新靶点。

研究证实，光敏色素的暗重排并非简单的随机过程，而是通过亚基间结构不对称性和动态氢键网络实现的精密调控。这为开发具有可控重排周期的光遗传学开关提供了理论依据，特别是通过工程化改变H277周围环境，可调控光敏色素的信号持续时间。例如，在光遗传学工具中引入类似结构不对称性的突变，可能实现精准的时序控制，这对治疗需要精确时间响应的神经疾病具有重要意义。该研究还表明，冷冻电镜在捕捉低丰度中间态方面具有潜力，为解析其他光控蛋白的动态过程提供了方法学参考。