《Experimental Eye Research》：ERK-mTOR crosstalk suppresses Autophagy and upregulates proteasomal degradation pathway to confer Chronic Myeloid Leukemia cells resistant to Imatinib
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XIAP降解途径在慢性髓系白血病耐药中起关键作用，通过激活ERK-mTOR轴抑制自噬并转向蛋白酶体降解，联合mTOR抑制和XIAP降解可逆转耐药。
Rajdeep Roy | Tamalika Paul | Pritam Kumar Das | Samraj Sinha | Siddhartha Sankar Ray | Maitreyee Bhattacharyya | Nabendu Biswas
印度加尔各答Presidency大学生命科学系
摘要
药物耐药性仍然是有效癌症治疗中的一个关键障碍。此前，我们已经证明抗凋亡蛋白XIAP的表达会促进慢性髓性白血病（CML）细胞对TRAIL（死亡诱导蛋白）的耐药性发展。然而，在获得药物耐药性（K562R和KCL22R）后，XIAP的降解途径从溶酶体途径转变为蛋白酶体途径。与正常对照组相比，肿瘤样本中的XIAP表达显著升高，在伊马替尼治疗失败（IMA-FL）的患者中，XIAP的表达水平也明显高于对伊马替尼有反应的患者（IMA-RP）。此外，我们发现伊马替尼耐药细胞中的蛋白酶体活性增加，而溶酶体途径受到抑制。从机制上讲，H?O?诱导的ERK-mTOR轴激活抑制了耐药细胞中的自噬作用，从而促进了降解途径的转变。非常有趣的是，通过mTOR抑制恢复自噬通量和使用H?O?诱导XIAP降解的双重干预能够逆转K562R细胞的伊马替尼耐药性。因此，我们的发现揭示了一种新的ERK–mTOR轴机制，该机制通过组合抑制mTOR和XIAP来上调蛋白酶体对XIAP的降解，这可能有助于克服CML中的伊马替尼耐药性。这项研究为克服癌症中的药物耐药性提供了新的治疗策略。
引言
维持蛋白质组的稳态对细胞的存活和功能至关重要。细胞不断合成和降解蛋白质，以确保蛋白质的正确折叠、组装以及异常或错误折叠蛋白质的及时清除。值得注意的是，新合成的蛋白质中有近三分之一会迅速被降解，这突显了蛋白质周转在细胞适应中的关键作用，尤其是在应激条件下[1]。
真核细胞中的蛋白质降解主要由两个主要系统调控：泛素–蛋白酶体系统（UPS）和自噬。这两个系统都受到严格调控，并且可以在多种生理或应激信号的刺激下被激活。目标蛋白质的泛素化通常是这两种途径的共同“死亡”信号。然而，越来越多的证据表明这两个系统之间存在功能上的相互作用，它们的激活及其下游效应高度依赖于细胞环境和刺激的性质[2]。为了做出这些复杂的决策，细胞依赖于复杂的信号网络，这些网络动态调节自噬和蛋白酶体降解之间的选择。
自噬与肿瘤细胞存活能力的增强和药物耐药性的增加越来越相关，尽管驱动这种耐药性的确切机制尚未完全明了。相比之下，UPS是细胞内蛋白质质量控制的关键调节器，特别是在细胞应激期间，它由一系列信号通路协同调控[3]。针对蛋白质降解途径的治疗潜力得到了蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米（Velcade?）、卡非佐米（Kyprolis?）和伊沙佐米（Ninlaro?）临床成功的支持，这些抑制剂均已获得FDA和EMA的批准，用于治疗多发性骨髓瘤（MM）和套细胞淋巴瘤（MCL）[4]。
尽管癌症治疗取得了显著进展，但在晚期癌症中的治疗效果仍然是一个巨大的挑战，主要原因是药物耐药性[5]。这种耐药性可能是先天性的，由预先存在的遗传或表观遗传因素引起，从而中和了治疗效果[6,7]；也可能是后天获得的，在治疗过程中由于适应性细胞机制的发展而产生[8,9]。虽然大多数研究集中在药物耐药性的转录和翻译调控上，但通过蛋白质降解进行的翻译后调控正逐渐成为一种重要的调控方式，能够更快、更直接地调节信号分子[10,11]。化疗和靶向疗法通过激活促死亡信号通路或抑制促存活通路来发挥作用[12]。然而，耐药肿瘤细胞经常通过上调抗凋亡蛋白（如Bcl-2、c-FLIP、XIAP和c-IAP）来规避这些效应，从而逃避凋亡[13, 14, 15]。了解这些抗凋亡蛋白的稳定性和降解机制对于阐明耐药机制和确定潜在的治疗干预措施至关重要。
在提出的克服耐药性的策略中，调节活性氧（ROS）提供了一个有前景的方法。ROS在癌症中具有双重作用——在低浓度下支持肿瘤进展，在高浓度下诱导细胞毒性[16,17]。
我们小组的最新研究发现，从槟榔叶中提取的天然多酚羟基查维科尔（hydroxychavicol）可以通过翻译后下调凋亡抑制蛋白（IAPs）来诱导TRAIL耐药的CML（K562）细胞发生凋亡[18]。在此基础上，本研究探讨了ROS驱动的信号通路如何调节自噬和蛋白酶体降解之间的相互作用，特别关注XIAP的调控——XIAP是一种在多种癌症中经常过表达的关键抗凋亡蛋白，与药物耐药性密切相关[19, 20, 21, 22, 23, 24]。我们的发现表明，XIAP在髓系肿瘤、伊马替尼治疗失败的患者以及耐药性CML（K562R和KCL22R）细胞中显著上调。我们强调了针对抗凋亡蛋白（如XIAP）进行降解的治疗潜力。这种方法可能恢复凋亡敏感性，并提高伊马替尼等靶向疗法在耐药性白血病细胞中的疗效。
材料
过氧化氢（H?O?）购自Merck Life Science Pvt. Ltd（印度）。抗体（如Bcl-2 (#3498)、XIAP (#14334)、PI3K (#4257)、pPI3K、Akt (#4691)、pAkt (#9271)、JNK (#3708)、pJNK (#4668)、ERK (#514302）、抗兔IgG和抗鼠HRP连接抗体、对照siRNA、mTOR siRNA I (#6381)、SAPK/JNK siRNA (#6232) 和ERK1/2 siRNA (#6560）购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州丹佛）。碘化丙啶（PI）购自Sigma-Aldrich。SureBeads?
方法
细胞系和细胞培养：慢性髓性白血病细胞系K562购自印度浦那的国家细胞科学中心。KCL22细胞系由印度加尔各答CSIR-IICB的Santu Bandyopadhyay博士赠送。K562 CML细胞系（包括对伊马替敏敏感和耐药的细胞）在含有1%青霉素-链霉素、0.1%庆大霉素和10% FBS的RPMI培养基中培养。对于耐药细胞，添加1.5 μg/ml的伊马替尼以维持药物效果
伊马替尼耐药CML细胞中升高的XIAP水平通过ROS降解
为了生成伊马替尼耐药的K562细胞（K562R），我们遵循了之前建立的方案[25]，使用亲本伊马替敏敏感的K562细胞系（K562S）。同样，伊马替尼耐药的KCL22细胞（KCL22R）也是从亲本KCL22S细胞发展而来的。通过使用2.5 μg/mL的伊马替尼进行MTT实验确认了K562R细胞的耐药性，该浓度超过了亲本K562S细胞的IC??值，显示出K562R细胞的药物敏感性显著降低
讨论
此前，我们的研究小组已经证明活性氧（ROS）在提高伊马替尼耐药性K562R细胞对TRAIL的敏感性方面起着关键作用，这是通过促进凋亡抑制蛋白（IAPs）的下调实现的[41]。基于这些发现，我们进一步研究了外源性ROS是否也能诱导IAPs的类似降解
结论与未来展望
总之，我们的发现首次揭示了一种依赖于ROS的差异性蛋白质稳态机制，该机制决定了伊马替敏敏感细胞与耐药CML细胞中抗凋亡蛋白的命运。我们确定mTOR作为一个核心分子开关，决定了蛋白质的溶酶体降解还是蛋白酶体降解，从而在伊马替尼耐药性的发展中起着关键作用。这项工作为针对mTOR–自噬–蛋白酶体的治疗干预开辟了新的途径
数据可用性声明
本研究的数据可应要求向相应作者索取。
资助
本研究得到了印度政府和工程研究委员会（资助编号SB/YS/LS-123/2014 & EEQ12019/000153）、印度医学研究委员会（资助编号NCD/Adhoc/222/2022-23）、DBT-BUILDER计划（资助编号BT/INF/22/SP45088 /2022）以及印度政府科技部和技术发展部–科技基础设施改进基金（DST-FIST）的支持。
