用于肝病中外泌体分离和代谢组学分析的胆固醇亲和识别技术

《Analytica Chimica Acta》：Cholesterol Affinity Recognition for Extracellular Vesicle Isolation and Metabolomics Analysis in Liver Disease

基于胆固醇印迹聚合物的尿液外泌体高效分离与代谢组学分析研究。通过反向微乳法制备胆固醇印迹聚合物（CHO-MIP），实现尿液外泌体快速富集（50分钟内，回收率79%，仅需4 mg样本）。结合超高效液相色谱-离子迁移-质谱技术，成功区分肝硬化、肝癌与健康对照组（AUC>0.7）。该方法显著提升外泌体分离效率及临床诊断实用性，为液体活检提供新策略。

　　

赵世龙|陈璐曦|卜爱香|吴光耀|于文静|胡亮海

中国吉林大学生命科学学院超分子结构与材料国家重点实验室超分子化学生物学中心，长春130012

摘要：

背景

细胞外囊泡（EVs）在血液、尿液和唾液等体液中大量存在，由于含有丰富的代谢物、蛋白质和核酸，已成为疾病诊断的有希望的生物标志物来源。然而，高效分离EVs仍然是一个重大挑战。目前常用的EV富集方法包括超速离心（UC）、尺寸排阻色谱（SEC）、基于抗体的亲和方法和聚合物沉淀。这些方法存在成本高、操作复杂和污染风险等问题。因此，迫切需要开发快速高效的分离EVs的方法。

结果

在本研究中，我们采用一锅法反向微乳技术合成了胆固醇印迹聚合物，实现了尿液EVs的快速高效富集。值得注意的是，该方法仅需要少量样本（4毫克）即可实现快速分离（50分钟）和高回收率（79%），在效率和实用性方面均显著优于传统技术。通过超高效液相色谱-离子迁移率-质谱联用技术，我们实现了EV代谢物的高分辨率分离和检测。该分析系统具有优异的灵敏度，对于1皮克的利血平，信噪比超过2000:1，质量精度高（分辨率≥80,000 FWHM）。对临床样本（9例肝硬化、12例肝癌和10例健康对照组）中的EVs进行代谢组学分析，成功区分了各组。对四种代表性代谢物的接收者操作特征（ROC）分析显示，曲线下面积（AUC）值大于0.7，表明其具有很好的诊断潜力。

意义

总之，本研究开发的胆固醇印迹聚合物能够在50分钟内从2毫升尿液中高效富集和分离EVs。对临床样本中富集的尿液EVs进行代谢组学分析，成功区分了不同的病理状态。该方法为尿液EVs的富集提供了一种高效策略，并为更广泛的液体活检应用提供了有前景的平台。

部分摘录

引言

液体活检作为一种新兴的癌症诊断方法，提供了一种无创且易于取样的方式。液体活检的主要来源包括循环肿瘤细胞、无细胞DNA和细胞外囊泡（EVs）^[1]。由于具有磷脂双层结构，EVs相对稳定，并且已被证明广泛存在于血液、尿液和唾液等多种体液中^[2]。它们在细胞通讯^[3]、液体活检^[4]和药物递送中发挥着重要作用

分子印迹和非印迹聚合物的制备

• (1)
  反向微乳的形成。通过将480 μL去离子水和100 μL NH₃·H₂O与1.77 g Triton X-100、1.6 mL正己醇和6.5 mL环己烷均匀混合，制备了稳定的微乳。
• (2)
  模板分子的固定。向体系中加入10 μmol胆固醇（CHO）模板分子并混合10分钟，以确保分子分散。
• (3)
  印迹溶液的引入。印迹溶液由100 μL环己烷和120 μmol四乙基正硅酸盐组成

CHO-MIP的合成与吸附特性

图1A展示了通过反向微乳聚合合成CHO-MIP的示意图。合成得到的分子印迹聚合物的结合效率主要受两个关键因素影响：(1) 模板分子与功能单体之间的摩尔比；(2) 功能单体与交联剂之间的摩尔比。为了系统优化这些参数，我们评估了不同CHO与APTES摩尔比的印迹因子（IF）

讨论与结论

总结来说，我们利用反向微乳技术和分子印迹方法合成了对胆固醇具有特异性亲和力的分子印迹聚合物（CHO-MIP）。验证了这种聚合物对细胞膜上胆固醇的特异性和结合亲和力。在此基础上，该聚合物被用于富集和分离尿液中的EVs，并进一步用于捕获尿液中的EVs

CRediT作者贡献声明

赵世龙：撰写 – 原稿撰写、可视化、验证、实验设计、数据整理。陈璐曦：撰写 – 审稿与编辑、软件使用、资源获取、方法学设计、数据分析。胡亮海：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源管理、方法学设计、实验设计、资金申请、概念构思。卜爱香：数据验证。吴光耀：资源提供、项目管理、实验设计。于文静：撰写 – 审稿与编辑、数据验证。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号22374056）和吉林省卫生项目（项目编号2024WSZX-D19）的支持。