直接RNA测序技术革新：RNA004化学方法提升转录组评估与RNA修饰检测的临床转化前景

《Nucleic Acids Research》：Direct RNA sequencing enables improved transcriptome assessment and tracking of RNA modifications for medical applications

本研究针对纳米孔直接RNA测序(DRS)技术在临床应用中存在的通量低、准确性不足及缺乏大规模RNA修饰检测模型等问题，系统评估了最新RNA004化学方法结合新型修饰碱基识别模型在伪尿嘧啶(Ψ)和N6-甲基腺嘌呤(m6A)检测方面的性能突破。研究通过细胞系、合成寡核苷酸和人外周血样本验证显示，该技术显著提高了检测通量、准确性和位点特异性修饰检测能力，并首次实现METTL5甲基转移酶功能缺失患者的临床诊断应用，为RNA修饰相关疾病的分子诊断和RNA therapeutics质量评估提供了新技术范式。

　　

在生命科学领域，RNA修饰作为表观转录组学的重要研究方向，正日益展现出巨大的生物学意义和临床价值。目前已知的170多种化学修饰中，N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A)和伪尿嘧啶(Ψ)因其在RNA结构稳定性、蛋白相互作用以及翻译调控中的关键作用而备受关注。特别是在医学应用方面，RNA修饰异常与多种疾病密切相关，例如Ψ修饰在终止密码子处的出现可能诱导翻译通读，为遗传性疾病治疗提供新思路；而m⁶A修饰的失调则与肿瘤发生发展密切相关。

然而，传统的RNA测序技术存在明显局限性。基于下一代测序的技术需要将RNA逆转录为cDNA，这一过程会丢失天然RNA分子上的修饰信息，使得研究人员只能通过间接方式评估RNA修饰状态。牛津纳米孔技术公司推出的直接RNA测序技术革新了这一局面，它能够直接读取天然RNA分子，同时捕获全长转录本、剪接模式、poly(A)尾巴长度以及RNA修饰信息。但早期的SQK-RNA002测序试剂盒在通量、准确性和修饰检测能力方面仍存在不足，限制了其在临床环境中的应用。

为解决这些技术瓶颈，Charlotte Hewel、Anna Wierczeiko等研究人员在《Nucleic Acids Research》上发表了最新研究成果，系统评估了新一代RNA004化学方法的性能提升，并探索了其在临床诊断和RNA therapeutics开发中的实际应用价值。

研究团队采用了多维度的技术路线：首先通过Dorado v0.7.2碱基识别系统对RNA002和RNA004化学方法产生的数据进行比对分析，评估其在通量、质量和基因覆盖度方面的差异；利用modkit进行m⁶A和Ψ修饰位点识别，并建立严格的过滤阈值（覆盖度≥10 reads，修饰频率≥10%）；结合GLORI测序技术对m⁶A检测结果进行正交验证；针对临床样本（包括METTL5突变患者的外周血）开展靶向测序分析；使用tailfindr算法和Dorado内置功能评估poly(A)尾巴长度检测准确性。样本来源涵盖Universal Human Reference RNA、转染的HEK293T细胞、人外周血以及合成寡核苷酸等多种类型。

增强的性能和产量

研究结果显示，RNA004化学方法在所有样本类型中均表现出显著优势。在PromethION平台上，RNA004的单次运行产量达到17.3-21.94 Gb，而RNA002仅能达到其35%的产量。质量评估方面，RNA004的平均碱基质量Q分数和参考基因组比对一致性（接近98%）均显著优于RNA002，即使与经过优化的第三方碱基识别模型相比仍保持优势。错误模式分析表明，两种化学方法的主要错误来源均为缺失错误，但RNA004的错误率明显降低。

增强的基因表达分析

转录组覆盖度分析显示，基于RNA004化学方法的数据能够检测到更多的基因，特别是与孟德尔疾病相关的基因（Mendeliome）覆盖度达到40%-75%。主成分分析表明样本分离主要取决于生物类型而非测序化学方法，证明RNA004在转录组分析中的可靠性。基因体覆盖度从5'到3'端在两种化学方法间表现一致，表明RNA004在保持转录本完整性方面具有良好性能。

poly(A)尾巴长度评估

研究团队比较了tailfindr和Dorado在poly(A)尾巴长度估计方面的一致性，发现两者结果高度吻合。针对已知长度为30 nt的对照链（RCS）的分析显示，RNA002和RNA004化学方法均能准确检测预期长度。在实际样本中，不同基因（如DDX17、OLA1和SRP14）的poly(A)尾巴长度分布在两种化学方法间表现出高度一致性，相关系数达到0.79-0.89。

m⁶A修饰检测性能

研究团队建立了严格的修饰检测阈值（修饰概率≥0.98），有效降低了假阳性率。在染色体20区域的比较分析中，RNA004结合Dorado识别器检测到的m⁶A位点数量（1497个）显著多于RNA002结合mAFiA（475个）或m⁶ABasecaller（346个）的结果。即使在进行覆盖度校正后，RNA004仍保持优势。外周血样本的三次重复实验共检测到58,836个共享m⁶A位点，而体外转录对照样本中仅检测到249个假阳性位点。

与GLORI测序数据的相关性分析显示，相同技术内部重复间的m⁶A频率相关性（R²>0.93）高于不同技术间的相关性。DRACH motif分析表明，天然样本中的m⁶A分布符合已知特征，而体外转录样本中的假阳性分布则均匀分布在各种motif中。在孟德尔疾病相关基因中，研究人员鉴定出19,308个在三个血液样本重复中均被检测到的m⁶A位点，为疾病相关修饰研究提供了重要资源。

Ψ修饰检测特征

转录组范围内的Ψ扫描结果显示，外周血样本中检测到的Ψ位点数量较多（23,456-47,435个），但重复间共享位点较少（仅4,555个）。与m⁶A不同，Ψ修饰频率分布在天然样本和体外转录样本间差异不大，且相关性略低（r=0.82-0.92）。与数据库对比发现，血液样本中约4%-5%的检测位点与Tavakoli等报道的高置信度Ψ位点重叠，约20%与RMBase v3.0数据库中的已知位点重叠。

位点特异性修饰检测

研究人员利用Schartel等开发的靶向伪尿苷化系统验证了RNA004在位点特异性修饰检测中的性能。结果显示，Dorado识别器能够准确反映EGFP和mCherry报告基因中Ψ修饰的化学计量差异。特别值得注意的是，在某些高U>C错配率的位点，需要结合Dorado识别结果和错配分析才能获得准确的修饰频率估计。

METTL5功能缺失的临床验证

研究展示的首个DRS临床应用中，研究人员对一名携带METTL5基因复合杂合突变（c.224+5G>A和c.427A>T）的智力发育障碍患者进行了分析。DRS测序结果显示，约50%的METTL5转录本发生外显子2跳跃，证实了疑似致病性剪接突变的功能影响。更重要的是，在18S rRNA的A1832位点（METTL5的已知靶点）检测到m⁶A修饰水平显著降低，直接证明了METTL5功能缺失的分子后果。

研究结论与讨论部分指出，RNA004化学方法在测序通量、准确性和修饰检测能力方面的显著提升，为DRS技术在临床环境中的应用奠定了坚实基础。位点特异性修饰检测能力的验证表明，该技术可用于RNA therapeutics的质量控制，特别是在评估Ψ修饰诱导的翻译通读效果方面具有独特优势。METTL5相关病例的成功诊断则证明了DRS在RNA修饰病（RNA modopathies）分子诊断中的实用价值。

然而，研究也指出了当前RNA修饰检测技术存在的挑战，包括缺乏金标准数据集、模型复杂性以及持续存在的错误模式等。特别是对于低化学计量修饰位点的检测，仍需进一步优化算法和验证策略。研究人员强调，建立针对临床样本的可靠基准对于DRS技术的广泛应用至关重要，本研究在外周血样本中获得的可重复性数据为这一目标提供了重要基础。

随着RNA004化学方法的推广和用户基础的扩大，DRS技术有望在临床诊断、RNA therapeutics开发和表观转录组学研究领域发挥越来越重要的作用。未来的研究方向应包括扩大样本队列、建立组织特异性修饰参考数据集以及开发更高效的生物信息学工具，最终实现DRS技术在常规诊断中的全面应用。