基因工程改造抗衰老人间充质祖细胞促进脊髓损伤修复

《Life Medicine》：Genetically Engineered Senescence-Resistant Human Mesenchymal Progenitor Cells Promote Spinal Cord Injury Repair

本研究针对脊髓损伤(SCI)修复中细胞治疗面临的细胞衰老、存活率低等挑战，开发了FOXO3基因工程改造的抗衰老应激人间充质祖细胞(SRCs)。研究发现SRCs移植通过减轻神经炎症、保护神经元、促进内源性神经再生等多重机制改善SCI小鼠功能恢复，并证实SRC来源的外泌体(SRC-Exo)是关键效应因子。该研究为干细胞治疗和细胞无治疗策略提供了新思路。

　　

脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，会导致损伤平面以下运动、感觉和自主神经功能障碍，给患者带来巨大痛苦。全球范围内，脊髓损伤的患病人数已超过2000万，且每年新增约90万病例。尽管神经再生研究取得了显著进展，但临床上能够有效促进脊髓损伤后功能恢复的治疗策略仍然有限。

目前，间充质祖细胞(Mesenchymal Progenitor Cells, MPCs)因其自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节特性，在再生医学领域展现出广阔的应用前景。然而，基于干/祖细胞的疗法在临床转化中面临重大障碍，包括体外长期培养后出现的细胞衰老（表现为增殖和分化能力下降），以及移植后存活率低、滞留率差等问题。

为了克服这些限制，研究人员利用基因编辑技术，对FOXO3基因的两个关键磷酸化位点（S253和S315）进行改造，构建了具有增强的抗衰老和抗应激能力的基因工程人间充质祖细胞，称为抗衰老应激细胞(Senescence- and Stress-Resistant Cells, SRCs)。先前的研究表明，SRC干预不仅能延缓非人灵长类的自然衰老，还能在缺血性疾病模型中发挥治疗作用。然而，在脊髓损伤后的不利微环境（包括强烈的炎症反应、胶质瘢痕形成和神经元死亡）中，SRCs是否能发挥治疗作用尚不清楚。

在这项发表于《Life Medicine》的研究中，研究人员利用小鼠脊髓损伤模型，系统评估了髓内植入SRCs对神经修复的治疗效果。研究发现，SRCs移植改善了SCI小鼠的运动功能。更重要的是，SRCs通过双重机制发挥治疗作用：一方面减轻神经元和轴突丢失，同时刺激内源性神经再生；另一方面抑制神经炎症，并通过调节星形胶质细胞的分布来限制损伤扩大。尤为关键的是，研究人员发现SRCs来源的外泌体(Exosomes, SRC-Exo)是这些修复效应的关键介质，部分重现了细胞植入的益处，这为开发细胞无干细胞疗法提供了重要证据。

研究人员主要运用了基因编辑技术构建SRCs，通过细胞模型（包括克隆形成、SA-β-半乳糖苷酶染色、端粒长度分析、免疫荧光等）评估其抗衰老和抗应激特性；建立了小鼠脊髓挫伤模型，并通过髓内显微注射进行细胞移植和外泌体治疗；利用体内生物发光成像技术追踪移植细胞的滞留情况；通过步态分析进行行为学评估；采用免疫组织化学/免疫荧光染色进行组织学分析；并通过RNA测序(RNA-seq)分析外泌体治疗的转录组学机制。

SRCs的构建与表征

研究人员通过基因编辑技术靶向修饰FOXO3的两个关键磷酸化位点（S253和S315），有效阻断了FOXO3的磷酸化依赖性核输出，从而增强了其核稳定性和转录活性。定向分化技术成功生成了FOXO3基因工程的SRCs。功能表征显示，与野生型MPCs(Wild-Type Cells, WTCs)相比，SRCs表现出增强的增殖能力、更低的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性、更低的p21蛋白表达水平以及更长的端粒。在氧化应激（H₂O₂）和DNA损伤（UV）条件下，SRCs表现出更高的Ki67阳性增殖细胞比例和更低的p21阳性衰老细胞比例，证实了SRCs对衰老和应激的抵抗能力。

脊髓损伤小鼠模型的构建及MPCs的髓内示踪

研究人员成功建立了小鼠T10节段挫伤模型，该模型再现了人类SCI的关键特征，包括运动缺陷和神经组织损伤。通过髓内细胞注射和示踪方案，发现表达荧光素酶的SRCs在体内存活能力和组织滞留特性优于WTCs。

SRCs髓内植入促进脊髓损伤后的功能恢复

行为学分析表明，SRCs治疗改善了SCI小鼠的后肢运动协调性，表现为步长增加和步宽减小。

SRCs治疗减轻脊髓损伤后的早期炎症微环境

组织学分析发现，SRCs植入减少了损伤边界IBA1⁺小胶质细胞的积聚和损伤中心CD68⁺细胞的数目，并下调了核因子κB(NF-κB)核心亚基RELA的表达，表明SRCs通过抑制小胶质细胞/巨噬细胞的过度活化和调节NF-κB等关键炎症通路来改善炎症微环境。

SRCs促进脊髓损伤后的神经保护并营造促再生微环境

长期观察显示，SRCs植入减小了损伤中心的面积，增加了损伤边界区的神经元存活数量，诱导星形胶质细胞从平行于损伤方向转变为垂直于损伤方向的放射状排列（这种排列有利于轴突再生），增加了损伤区的神经纤维密度，并促进了SOX2⁺内源性神经干/祖细胞在损伤中心的聚集。

SRCs来源的外泌体介导脊髓损伤后的神经保护和功能恢复

研究人员成功分离了SRCs来源的外泌体(SRC-Exo)，其具有典型的杯状形态和特征性标记物（HSP70、CD63、TSG101、CD81、CD9）。将SRC-Exo精确注射到SCI部位，发现其能部分重现SRCs植入的治疗效果，包括减小损伤面积、减轻损伤边界区神经元丢失、促进SOX2⁺细胞向损伤中心募集，并改善运动功能。

SRCs来源的外泌体重编程脊髓损伤相关的转录组

RNA测序分析表明，SRC-Exo治疗部分逆转了SCI诱导的转录组扰动。SRC-Exo挽救了8.33%的SCI特异性上调基因（称为救援下调基因），这些基因主要富集于免疫调节和炎症反应；同时挽救了6.26%的SCI特异性下调基因（称为救援上调基因），主要富集于突触信号和G蛋白偶联受体(GPCR)通路。例如，SRC-Exo下调了免疫激活相关基因Tlr8（NF-κB通路的已知调节因子），而上调了神经递质相关基因Gabrd和Cabpl（通过调节离子通道活性促进神经信号传递）。

综上所述，该研究揭示了基因工程SRCs及其外泌体通过多重协同机制促进脊髓修复：直接的神经保护作用（减少神经元丢失和轴突变性，激活内源性神经发生）和微环境重塑（调节神经炎症反应和星形胶质细胞形态极化，建立利于再生的微环境）。研究不仅拓展了对干/祖细胞治疗机制的理解，而且为SCI的临床治疗提供了两种潜在策略：基于细胞移植的疗法和基于外泌体的细胞无疗法，均具有重要的转化医学价值。值得注意的是，研究中观察到SOX2⁺神经干/祖细胞在损伤中心大量聚集，且SRCs植入进一步增加了其数量，这可能促进了内源性神经再生。未来研究可聚焦于阐明这些SOX2⁺细胞的精确起源、迁移路线、分化路径以及外泌体中参与此过程的具体趋化因子。

研究的局限性在于外泌体中具体的抗炎和神经保护因子尚未明确，且临床相关性受限于小鼠模型与人类中枢神经系统存在的物种差异，未来需要在非人灵长类动物中进行验证。尽管如此，这项工作为基于干细胞的神经再生研究奠定了坚实的基础。该研究由首都医科大学宣武医院、中国科学院动物研究所等多个单位的研究团队合作完成，并获得了多项国家级和省级科研项目的支持。